NAC飼喂努比亞山羊對ADCY8、PIK3R2基因在性腺軸組織表達水平研究

洪 磊，駱金紅，敖 葉，唐 文，韋仕南，陳 祥*

(1.貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點試驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點試驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025)

努比亞山羊體格高大、產(chǎn)肉率高、生長速度快等特點，是我國目前生長速度最快和體格最大的山羊品種，成年公羊一般體重可達100 kg以上，成年母羊可達70 kg以上[1]。提高努比亞山羊的繁殖性能將有助于提高生產(chǎn)效益。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是天然氨基酸L-半胱氨酸與還原性谷胱甘肽(GSH)的前體物質，化學名稱為2-氨基-3-巰基丙酸[2]。GSH具有強抗氧化作用，可以提高卵母細胞的質量[3]。NAC在肝臟、肌肉、腎臟和肺臟中含量較豐富[4]，對肝臟保護、生殖免疫、細胞凋亡調節(jié)、抑制炎性等方面均有一定的作用[5-7]。侯永清等[8]研究發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加NAC對仔豬生長性能有促進作用，NAC也可以通過降低血清雄激素和游離睪酮水平，最終輔助誘導多囊卵巢綜合征患者排卵提高生殖率[2]。

腺苷酸環(huán)化酶8(Adenylate Cyclase 8,ADCY8)是一種蛋白質編碼基因[9]，其相關通路包括卵巢類固醇生成和G蛋白信號通路。ADCY8基因與卵母細胞減數(shù)分裂、孕激素介導的卵母細胞成熟等有關[10]。ADCY8也在參與控制能量平衡和營養(yǎng)的下丘腦中表達[11]。磷脂酰肌醇-3-激酶調控亞基2(Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 2，PIK3R2)是PI3K p85亞基家族的一員，它降低了PI3K/AKT通路的生理激活，該通路調節(jié)細胞增殖、存活、侵襲、轉移和血管生成[12]。PIK3R2基因參與調節(jié)胰島素分泌[13]、抵抗細胞凋亡[14]、調控磷酸化等過程。目前NAC及ADCY8、PIK3R2基因研究主要集中在牛[15]、豬[16]、大鼠[17]上，在羊上的研究較少。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠早期(配種后0～30 d)飼喂0.07%NAC的努比亞山羊產(chǎn)羔率最高，因此本試驗通過探究ADCY8、PIK3R2基因在妊娠早期(配種后0～30 d)飼喂0.07% NAC的努比亞山羊性腺軸組織中表達量變化，旨在從基因水平來探討NAC對努比亞山羊繁殖性能的影響，為NAC對山羊繁殖相關基因的調控作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物來自貴州省冊亨海銘巍生態(tài)畜牧業(yè)開發(fā)有限公司種羊場，選擇3～4歲產(chǎn)羔2～3胎次的努比亞山羊母羊30只，對照組、試驗組各15只，配種后的第二天于試驗組飼糧中添加0.07%的NAC，飼喂當天記為0 d，持續(xù)飼喂30 d后分別采取對照組、試驗組努比亞山羊下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

NAC(珠海市泛海生物技術有限公司，純度≥97%)；Trizol試劑(貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司)；液氮、氯仿、0.5%TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖，所用試劑均為市購；熒光 primer、逆轉錄試劑盒均購自擎科生物科技有限公司。

1.3 試驗儀器

PCR擴增儀(C1000 TouchTM)、實時熒光定量PCR儀(型號為CFX96 Real-Time System)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)，均購自美國BIO-RAD有限公司；紫外可見分光光度計，購自美國Thermo Fisher有限公司；電泳儀(DYY-2C型)，購自北京市六一儀器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 RNA提取和cDNA的合成 利用TRIzol試劑盒提取努比亞山羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織的RNA。將各個組織RNA稀釋成同等濃度后，利用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。將提取后的RNA按20 μL體系進行反轉錄為cDNA，體系為：dNTP Mix 4 μL、RT Buffer 4 μL、primer Mix 2 μL、RNA模板2 μL、DTT 2 μL、HiFiscript 1 μL和RNase-Free Water 5 μL加入PCR小管，振蕩混勻，離心后，于PCR儀上42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min；反應結束后，取1 μL反應產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設計 根據(jù)GenBank上傳的ADCY8基因、PIK3R2基因序列，設計ADCY8、PIK3R2基因引物(Primier 6.0軟件)，以β-actin為內參基因，送至上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.3 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化及反應 在其他條件相同的情況下，對退火溫度和引物濃度進行摸索、優(yōu)化，篩選最佳退火溫度和引物濃度，確定最佳反應體系及退火溫度，用于下一步的實時熒光定量PCR試驗。檢測ADCY8、PIK3R2基因在努比亞山羊下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管5個組織中的表達量。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL；上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)；cDNA 1 μL (1 500 ng/μL)；ddH2O 7 μL。程序如下：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s；65 ℃退火5 s；72 ℃延伸15 s；進行40個循環(huán)，95 ℃，15 s；最后從60 ℃按0.5 ℃增值到95 ℃進行溶解曲線分析，熒光采集時間為5 s，每個樣品進行3個平行試驗。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法 試驗數(shù)據(jù)應用2-△△Ct法分析ADCY8、PIK3R2基因在5個組織中的差異表達量，SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，使用LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 ADCY8、PIK3R2基因的PCR擴增

以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板對ADCY8、PIK3R2基因進行PCR擴增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果由圖1可見，目的產(chǎn)物條帶明亮、無拖尾，與目的片段大小(ADCY8 139 bp、PIK3R2 146 bp)一致，可進行下一步試驗。

2.2 q-PCR的擴增曲線和溶解曲線

由圖2、圖3可知：實時熒光定量PCR試驗后得到的熒光擴增曲線和熒光溶解曲線，ADCY8(圖2)、PIK3R2(圖3)在5個組織中擴增曲線呈現(xiàn)光滑完整的“S”形狀，曲線平滑無特殊趨勢。循環(huán)閾值全部處于擴增曲線的對數(shù)期，溶解曲線全部呈單峰，峰值較好，無雜峰，無引物二聚體，達到試驗要求。

2.3 ADCY8、PIK3R2基因在不同組織中的表達

由圖4、圖5可知：ADCY8、PIK3R2基因在對照組和試驗組努比亞羊子宮、輸卵管、垂體、下丘腦、卵巢5個組織中均有不同程度的表達。ADCY8在垂體和下丘腦表達中，對照組極顯著高于試驗組(P<0.01)，在子宮中試驗組極顯著高于對照組(P<0.01)，在卵巢中均呈現(xiàn)低度表達；PIK3R2在垂體和下丘腦中，對照組極顯著高于試驗組(P<0.01)，卵巢、輸卵管、子宮差異不顯著。由圖4可知：ADCY8在對照組表達中，下丘腦極顯著高于其他組織(P<0.01)；在試驗組表達中，子宮極顯著高于其它組織(P<0.01)，垂體和下丘腦極顯著高于卵巢和輸卵管(P<0.01)。由圖5可知：PIK3R2基因在對照組表達中，垂體極顯著高于其他組織(P<0.01)，下丘腦極顯著高于卵巢、輸卵管、子宮(P<0.01)，子宮極顯著高于卵巢和輸卵管(P<0.01)；在試驗組表達中，子宮和垂體極顯著高于卵巢、輸卵管、下丘腦(P<0.01)。

3 討 論

3.1 NAC對努比亞山羊ADCY8基因表達影響

NAC有多方面的生物學功能，在醫(yī)學上研究非常廣泛，近年來也受到廣大畜牧行業(yè)者的關注。NAC可在體內轉化為能夠刺激谷胱甘肽(GSH)合成、促進解毒、直接清除自由基的代謝物，且NAC可以提高紅細胞、肝組織和肺組織中細胞內的谷胱甘肽含量[18]，保護肝臟和腎臟免受氧化應激損傷。張偉等[19]研究表明飼糧中添加0.05%NAC能有效緩解脂多糖(LPS)刺激引起的負面影響，提高腸黏膜的抗氧化能力。ADCY8基因在卵巢、睪丸、腎上腺等組織均有一定水平表達[20]，本研究發(fā)現(xiàn)卵巢在對照組和0.07%NAC組中均有表達，與前人檢測結果相同。Raoux等[13]敲除了下丘腦中的ADCY8，以評估ADCY8在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中樞調控中的必要性，最后證實ADCY8在人胰島中表達。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)ADCY8參與雌激素信號通路，它受雌激素受體和雌激素的正向調節(jié)而雌激素能夠有效刺激乳腺細胞生長發(fā)育[22]。因此，提高ADCY8基因的表達將有助于山羊生產(chǎn)性能的提高。本研究發(fā)現(xiàn)ADCY8在下丘腦表達中，對照組極顯著高于0.07%NAC組，說明NAC飼喂后ADCY8在下丘腦的表達量下調，因此可能會影響動物泌乳。而子宮內膜接受能力是哺乳動物胚胎植入成功的關鍵，Zhang等[23]研究推測ADCY8可能在子宮內膜接受能力的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可以提高子宮內膜的接受能力，促進胎兒著床。本研究發(fā)現(xiàn)該基因在子宮和輸卵管中的表達量上調，提示NAC可能直接作用于子宮和輸卵管對繁殖方面產(chǎn)生影響，其作用機理還有待進一步研究。

3.2 NAC對努比亞山羊PIK3R2基因表達影響

本試驗結果表明添加NAC使得山羊5個組織PIK3R2基因表達均降低，在下丘腦中，對照組極顯著高于0.07%NAC組。目前，對PIK3R2的研究主要是基于其對各種細胞信號通路的影響，但是目前在山羊繁殖相關影響上研究較少。Hu等[24]研究表明，miR-126通過下調PIK3R2的表達來促進老鼠血管生成，抑制炎癥，并對挫傷后的恢復產(chǎn)生積極影響。在Salajegheh等[25]研究中，PIK3家族中PIK3R2及其亞型的突變與抗癌藥物耐藥性的發(fā)生有關，PIK3R2在血管生成通路中起負調節(jié)作用。本研究中飼喂NAC后PIK3R2基因在5個組織中表達量均下調，說明飼喂NAC可能通過維持子宮內環(huán)境的健康、促進妊娠期血管的生成來保證胎盤、胚胎的良好發(fā)育。Cheung等[26]研究發(fā)現(xiàn)PIK3R2是與癌癥相關的基因。楊文芝[27]研究表明，miR-126靶向PIK3R2通過調節(jié)PI3K/AKT信號通路有助于成纖維細胞的增殖并抑制其凋亡，因此抑制miR-126可能改善成纖維細胞增殖與調亡之間的失衡。Du等[28]研究證明miR-126-3p下調通過靶向PIK3R2促進肝癌轉移和血管生成。因此降低PIK3R2基因的表達將可能有助于妊娠動物細胞代謝與增殖，調節(jié)細胞生長平衡來維持母體與胎兒健康。本研究發(fā)現(xiàn)PIK3R2在努比亞山羊性腺軸組織中均有表達，但飼喂NAC下調了PIK3R2在山羊5個組織的表達，推測該基因可能有助于提高山羊繁殖性能，為進一步研究PIK3R2對繁殖影響提供參考。

4 結 論

ADCY8、PIK3R2基因在努比亞山羊性腺組織中均有不同程度的表達，NAC的添加使得ADCY8、PIK3R2基因在5個組織表達產(chǎn)生變化，ADCY8基因在對照組下丘腦和垂體的表達量高于0.07% NAC組，而0.07% NAC組子宮的表達量高于對照組；PIK3R2基因在對照組垂體和下丘腦表達量高于0.07% NAC組。說明NAC的添加使ADCY8在垂體和下丘腦中表達量下調，子宮表達量上調，PIK3R2表達量均下調，此結果可為NAC對山羊繁殖相關基因表達影響研究提供參考。