短肋多指綜合征3型一家系的臨床表型和DYNC2H1基因突變分析

詹 瑛,張建芳,程 璐,徐 盈,陳必良

(1解放軍第63750部隊(duì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710043;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:zhzhhao@163.com)

骨骼發(fā)育不良是一類異質(zhì)性很大的遺傳性疾病,主要與軟骨和骨骼發(fā)育過程異常有關(guān)。國(guó)外的一項(xiàng)研究報(bào)道指出目前有226個(gè)基因與456種已知的遺傳性骨骼發(fā)育不良相關(guān)[1]。短肋多指綜合征(short-rib polydactyly syndromes, SRPSs)就是其中的一組骨骼發(fā)育不良癥候群,是由纖毛功能紊亂導(dǎo)致的以肋骨短小、長(zhǎng)骨短小、多指(趾)畸形,伴多臟器損害為特征的一種罕見的常染色體隱性單基因遺傳病。根據(jù)國(guó)際骨軟骨發(fā)育不良分類,已識(shí)別出4種不同類型的SRPS[2]。其中短肋多指綜合征3型(short-rib polydactyly syndrome type Ⅲ,SRPS Ⅲ)是其中表型最重、預(yù)后較差的一種,往往妊娠中期以后宮內(nèi)即有影像學(xué)的異常表現(xiàn)。盡管影像學(xué)技術(shù)現(xiàn)今取得了巨大的進(jìn)步,但胎兒骨骼發(fā)育不良數(shù)量眾多且表型特征往往多有重疊,故而仍然難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷。鑒于該類疾病各種形式的廣泛的遺傳型和表現(xiàn)型異質(zhì)性,基于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序確定可能的致病基因是不切實(shí)際、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。因此,基于二代測(cè)序(NGS)技術(shù)的靶向捕獲、全外顯子測(cè)序、全基因組測(cè)序等為識(shí)別遺傳性骨骼疾病的致病突變提供了一種新的高效的方法。

本研究基于NGS采用全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing,WES)的方法對(duì)一個(gè)SRPS Ⅲ家系引產(chǎn)胎兒進(jìn)行全外顯子測(cè)序,數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示該先證者的DYNC2H1基因存在復(fù)合雜合突變c.2346-1G>A和c.7292+4T>C,再結(jié)合PCR和Sanger測(cè)序在該家系中進(jìn)行驗(yàn)證,先證者兩處變異分別遺傳自其父母,符合SRPS Ⅲ常染色體隱性遺傳的規(guī)律。從遺傳學(xué)的角度初步明確了該家系中先證者SRPS Ⅲ的可能發(fā)病原因,為其臨床診斷提供了有力的證據(jù),為該家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了可靠的分子依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

該家系中母親孕2產(chǎn)0,2016年及2017年均因“胎兒四肢極度短小”于孕中期引產(chǎn)。夫妻雙方非近親結(jié)婚,否認(rèn)雙方家族中遺傳病史。2016年6月第1次妊娠,孕早期經(jīng)過順利,孕13周時(shí)西安市第四醫(yī)院產(chǎn)科超聲提示胎兒雙肺回聲增強(qiáng)、胎兒四肢形態(tài)異常,未見明確長(zhǎng)骨回聲,腹腔囊性包塊,鼻骨顯示不清;連續(xù)4周超聲動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胎兒骨骼系統(tǒng)發(fā)育情況仍提示胎兒四肢形態(tài)異常,成骨發(fā)育不全可能。該家系決定終止妊娠,由于當(dāng)時(shí)就診醫(yī)院客觀條件受限,引產(chǎn)胎兒未做尸檢,未留取樣本進(jìn)一步行基因檢測(cè)。2017年4月該家系中母親第2次妊娠,孕12周西安市第四醫(yī)院產(chǎn)科超聲檢查提示胎兒全身皮膚水腫,頭頸部淋巴水囊瘤,建議加強(qiáng)產(chǎn)檢、進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷。孕17周時(shí)復(fù)查超聲提示胎兒頸部水囊瘤,雙腎盂重度積水,胎兒四肢長(zhǎng)骨短小、雙手可見多指,胎兒心臟異常,建議進(jìn)一步胎兒心動(dòng)超聲及產(chǎn)前診斷。該孕婦及家屬堅(jiān)決要求終止妊娠,且為求進(jìn)一步遺傳咨詢轉(zhuǎn)往西京醫(yī)院。于孕17+4周時(shí)引產(chǎn),引產(chǎn)胎兒為男性體征,查體可見全身皮膚輕度水腫,四肢明顯短小,雙手六指畸形,余外觀未見明顯異常。留取引產(chǎn)胎兒臍帶組織行基因檢測(cè)。

1.2 基因組DNA提取

該家系夫妻雙方知情同意,簽署知情同意書后,采用EDTA抗凝管抽取該夫妻雙方靜脈血各5 ml,按血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取外周血基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 全外顯子測(cè)序

將該家系中二胎患病胎兒的新鮮臍帶組織5 g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎后放入研缽,倒入液氮磨成粉末,按DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)說明書提取胎兒DNA,送至北京金準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,利用Agilent SurSelect人全外顯子組芯片捕獲試劑盒構(gòu)建文庫,使用Illumina Hiseq X Ten測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序,數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制后與基因組參考序列進(jìn)行比對(duì),查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫綜合分析判斷可疑變異的致病性。

1.4 PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)全外顯子高通量測(cè)序的結(jié)果,用PCR結(jié)合Sanger測(cè)序?qū)Χヌ杭捌涓改高M(jìn)行突變檢測(cè)和驗(yàn)證。針對(duì)DYNC2H1基因的c.2346-1G>A和c.7292+4T>C位點(diǎn)采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)跨越16號(hào)、44號(hào)外顯子上下游的引物序列。DYNC2H1-16F:TGGCTTAGCAACTGTAGAAGCA,16R:AGCCCGGATTTCTTCAAAAG;DYNC2H1-44F:TTGACGTATCAAGGATTTTATG,44R:CTGTTCATACACTTGTACCAT。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),之后進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子高通量測(cè)序結(jié)果

引產(chǎn)胎兒基因組DNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)胎兒DYNC2H1基因存在c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異兩處雜合突變(見圖1),兩處變異在人群dbSNP數(shù)據(jù)庫、HGMD數(shù)據(jù)庫、ClinVar數(shù)據(jù)庫中均未見報(bào)道。查閱HGMD與ClinVar數(shù)據(jù)庫,DYNC2H1基因據(jù)報(bào)道與短肋多指綜合征相關(guān)。短肋多指綜合征為常染色體隱性遺傳病,上述兩處變異均為DYNC2H1基因內(nèi)含子區(qū)域的變異,其中c.2346-1G>A位點(diǎn)變異位于16號(hào)內(nèi)含子-1位,緊鄰17號(hào)外顯子,處于“經(jīng)典剪接區(qū)域”,該區(qū)域的堿基突變一般均會(huì)對(duì)原剪切位點(diǎn)產(chǎn)生影響;c.7292+4T>C位點(diǎn)變異位于44號(hào)內(nèi)含子+4位,緊鄰44號(hào)外顯子,緊挨“經(jīng)典剪接區(qū)域”，該區(qū)域的堿基突變一般均會(huì)對(duì)原剪切位點(diǎn)產(chǎn)生影響。DYNC2H1基因上述兩個(gè)位點(diǎn)的變異高度懷疑會(huì)影響轉(zhuǎn)錄水平內(nèi)含子序列的剪切,進(jìn)而影響DYNC2H1基因所編碼的蛋白質(zhì)功能。利用Human Splicing Finder軟件(http://www.umd.be/HSF/)對(duì)上述兩個(gè)內(nèi)含子區(qū)域位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)的在線預(yù)測(cè),結(jié)果提示,c.2346-1G>A位點(diǎn)對(duì)于剪切影響的可能超過70%,c.7292+4T>C位點(diǎn)可能不影響原有的剪接方式(見圖2)。

圖2 HSF生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)DYNC2H1基因變異位點(diǎn)的影響Figure 2 The predicted influence of DYNC2H1 gene mutations through HSF software

圖1 胎兒DYNC2H1基因變異位點(diǎn)在基因序列中的位置Figure 1 The locations of the fetal mutations on DYNC2H1 gene sequencing

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示,患病胎兒DYNC2H1基因c.2346-1G>A、c.7292+4T>C的復(fù)合雜合突變分別來自該家系中的母親及父親,其父母分別為上述雜合突變的攜帶者,該遺傳方式符合常染色體隱性遺傳(見圖3),如果上述兩處變異為致病性突變,該家系再次妊娠有1/4的概率生育患者。

圖3 該家系中DYNC2H1基因變異Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果Figure 3 The validation of the mutations of DYNC2H1 gene in the affected family

3 討論

遺傳性骨病是指由于遺傳物質(zhì)改變導(dǎo)致骨骼畸形的一類遺傳性疾病,它是一大類具有遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性的骨軟骨發(fā)育不良病。這類疾病大多是發(fā)病率很低的罕見病,但種類繁多,總發(fā)病率大于1/5 000[3]。這些骨病發(fā)病早,癥狀明顯,以骨骼塑形、生長(zhǎng)、分化、內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常為主要特征,通常造成患者致殘甚至致死,其發(fā)病率與死亡率相當(dāng)可觀,而且此類骨病還會(huì)逐代或隔代遺傳,故危害十分嚴(yán)重,往往給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。短肋多指綜合征(SRPSs)是其中的一種常染色體隱性遺傳性骨病。雖然SRPSs影像學(xué)表現(xiàn)往往以肋骨短小、長(zhǎng)骨短小、多指(趾)畸形、伴多臟器損害為特征,但其病情輕重程度、病因及預(yù)后往往多種多樣,而且常在胎兒發(fā)育期間宮內(nèi)即有表現(xiàn),產(chǎn)前診斷SRPSs難度很大,許多時(shí)候孕婦在尚未查明病因時(shí)便選擇了終止妊娠,無法為再次妊娠提供產(chǎn)前診斷的可靠依據(jù)。根據(jù)國(guó)際骨軟骨發(fā)育不良分類,四種不同類型的SRPSs已被確認(rèn),分別為SRPS Ⅰ型(Saldino-Noonan綜合征)、SRPS Ⅱ型(Majewski綜合征)、SRPS Ⅲ型(Verma-Naumoff綜合征)、SRPS Ⅳ型(Beemer-Langer綜合征),其中SRPS Ⅰ型和SRPS Ⅲ型目前已被認(rèn)為是同一類型,也是表現(xiàn)最為嚴(yán)重的一種類型[2,4]。目前與SRPS Ⅲ型相關(guān)的致病基因均屬于鞭毛細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸(IFT)相關(guān)基因,如DYNC2H1、IFT80、WDR34、WDR35、WDR60等[5-8]。

本研究中孕婦連續(xù)兩胎均出現(xiàn)相同的臨床表型,遺傳性骨骼疾病和單基因病的可能性非常大[9]。本課題組用家系全外顯子組測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胎兒DYNC2H1基因存在復(fù)合雜合突變(c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異)。DYNC2H1基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示,胎兒c.2346-1G>A和c.7292+4T>C分別來自健康的母親和父親,符合常染色體隱性遺傳方式。DYNC2H1基因位于染色體11q22.3,長(zhǎng)13 kb,有90個(gè)外顯子。目前我國(guó)僅有數(shù)例散發(fā)SRPS Ⅲ型病例報(bào)道是由DYNC2H1基因突變所致[10-13],而且具有明顯的遺傳異質(zhì)性和表型多樣性。DYNC2H1基因編碼胞質(zhì)動(dòng)力蛋白亞基重鏈,是纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體A的組成部分,在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中,纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體A與胞內(nèi)信號(hào)分子結(jié)合,胞質(zhì)動(dòng)力蛋白亞基與纖毛頂部的雙微管結(jié)合,并沿著雙微管從纖毛頂部向底部移動(dòng),并參與纖毛蛋白的循環(huán)利用。表明DYNC2H1蛋白在哺乳動(dòng)物纖毛的延伸組成和形態(tài)維持方面都具有關(guān)鍵的作用,而纖毛是軟骨內(nèi)骨發(fā)育過程中的重要組成部分[14]。纖毛結(jié)構(gòu)廣泛分布于真核動(dòng)物的各類細(xì)胞中,其結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守,所以DYNC2H1基因的致病性變異表現(xiàn)為以軟骨、骨骼成骨異常為主要表型特征,伴隨多系統(tǒng)畸形的一組異型性疾病。Schmidts等[15]檢測(cè)到DYNC2H1基因敲除影響秀麗隱桿線蟲和小鼠的纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)功能,導(dǎo)致纖毛發(fā)育異常,并觀察到與骨骼發(fā)育緊密相關(guān)的Hedgehog信號(hào)通路出現(xiàn)異常調(diào)控,導(dǎo)致骨骼發(fā)育缺陷。SRPS Ⅲ型是一種典型的骨骼纖毛疾病,初級(jí)纖毛和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白是骨骼發(fā)育過程中形態(tài)發(fā)生途徑的必要組成部分,細(xì)胞纖毛運(yùn)輸?shù)鞍自谲浌羌?xì)胞的成熟方面具有非常重要的作用[16]。

截止2020年4月,ClinVar數(shù)據(jù)庫已報(bào)道DYNC2H1基因致病或可能致病的變異位點(diǎn)有236個(gè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/),而本研究發(fā)現(xiàn)的兩處可疑致病位點(diǎn)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。研究表明DYNC2H1基因龐大尚沒有熱點(diǎn)突變,這些突變基本都是復(fù)合雜合突變,但到目前為止并沒有發(fā)現(xiàn)純合突變,沒有純合子的形成可能是因?yàn)樵摶蜻^于保守和關(guān)鍵,純合子的早期胚胎已死亡[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)的c.2346-1G>A變異和c.7292+4T>C變異均位于DYNC2H1基因內(nèi)含子區(qū)域,生物信息學(xué)軟件借助特定算法預(yù)測(cè)其一高度可能影響剪切受體,其一可能不影響原有剪切,但是否真正影響剪切只有通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證才能確定。綜上所述,對(duì)于該家系課題組利用WES技術(shù)在該家系中篩選出了兩個(gè)高度可疑的DYNC2H1基因致病位點(diǎn),且在家系中存在遺傳共分離現(xiàn)象,結(jié)合臨床表型分析,上述兩個(gè)位點(diǎn)很可能是該家系的致病位點(diǎn),建議家系再次妊娠之前完成其致病性的驗(yàn)證,可以定制Minigene驗(yàn)證上述兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)DYNC2H1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,進(jìn)而分析其致病性。若為致病性變異,則可以根據(jù)上述兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)前診斷或是胚胎植入前遺傳學(xué)診斷,從而實(shí)現(xiàn)SRPS Ⅲ型患者在家族中的阻斷,指導(dǎo)家系成員實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

近些年來二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床疾病的基因突變檢測(cè),研究者可以根據(jù)基因突變的特點(diǎn)與其他傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合使用,相互配合取長(zhǎng)補(bǔ)短,幫助臨床上更加經(jīng)濟(jì)、精準(zhǔn)、快速地診斷疾病。遺傳性骨病的致病基因種類繁多,每個(gè)基因的致病位點(diǎn)動(dòng)輒上百,如果用Sanger測(cè)序逐一排查經(jīng)濟(jì)效率極其低下,所以本研究選擇NGS和Sanger測(cè)序相結(jié)合的方法進(jìn)行基因診斷,可以快速準(zhǔn)確找到致病基因及致病位點(diǎn),大大提高檢測(cè)效率。