改良式背部正中單切口入路卵巢切除術構建大鼠骨質疏松模型的研究

劉攀杰,李永賢,馬延懷,張順聰,袁 凱,郭丹青,羅培杰,郭惠智

(1廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院脊柱骨科,廣州 510000;2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科;*通訊作者,E-mail:drzsc@sina.com)

骨質疏松癥已成為我國面臨的重要公共健康問題[1]。隨著人口老齡化的加劇,骨質疏松癥尤其是絕經后骨質疏松癥的發(fā)生率逐漸上升。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前我國骨質疏松癥患者近7 000萬,骨量減少者超過2億人[2]。骨質疏松癥最嚴重的并發(fā)癥就是骨質疏松性骨折,具有骨質量差、愈合緩慢和發(fā)病率高、致殘致死率高、治療費用昂貴等特點。因此,骨質疏松預防及治療相關研究顯得尤為重要。動物實驗被廣泛應用于骨質疏松癥的研究[3],而動物模型的構建是其重要前提和基礎。據(jù)文獻報道[4],雌激素缺乏的大鼠,其骨代謝變化與人類十分相似,因而在骨質疏松癥病理機制、診斷、治療藥物的藥代動力學等方面具有相當高的參考價值。1969年,Saville[5]首次建立了大鼠絕經后骨質疏松模型,此后經反復證實,雙側卵巢切除法已廣泛應用于絕經后骨質疏松的研究。雖然該去勢模型仍有一定的局限性,但由于該模型成功率高、穩(wěn)定性可靠、重復性好、適用范圍廣,目前為止,已成為骨質疏松模型和其他去除雌激素影響的模型廣泛使用的方法[6,7]。據(jù)以往文獻報道,背側部雙切口入路去卵巢術較腹部正中切口入路及腹股溝切口入路更為安全便捷,因而被廣泛推崇[8]。然而,背側部雙切口入路仍有些許缺陷,如術口易開線、感染等。因此,筆者在背部雙切口入路去卵巢術基礎上,提出改良式背部正中單切口入路去卵巢術。本研究旨在比較改良式背部正中單切口入路與背部雙切口入路兩種造模方式的安全性及便捷性,為進行去卵巢相關研究的廣大科研工作者提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體質量(250±30)g,購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。大鼠分籠飼養(yǎng),由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物實驗中心提供大鼠專用飼料,自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫24 ℃,日照12 h,相對濕度45%-65%,通風良好。適應環(huán)境2周后開始實驗。采用單純隨機對照實驗方法,將30只大鼠1-30隨機編號,采用隨機數(shù)表法完全隨機分組,平均分為背部雙切口組(OVXD)、背部正中單切口組(OVXS)、假手術組(sham)各10只。

1.2 儀器與材料

micro-CT(Skyscan1172,bruker公司,比利時);麻醉藥物(1%戊巴比妥鈉),碘伏,75%酒精,注射用青霉素鈉(160萬U),500 ml 0.9%氯化鈉注射液,手術刀,手術剪,眼科剪,手術鑷,組織鉗,止血鉗,持針器,角針,非吸收性外科縫線,無菌紗布及棉球,無菌中單,5 ml注射器,1 ml注射器。

1.3 背側部雙切口入路去卵巢手術

大鼠術前禁食12 h,腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉溶液(45 mg/kg)麻醉,俯臥位固定,在背部雙側肋緣下與尾骶段廣泛性備皮剃毛,分別用碘伏和酒精于術部消毒,覆蓋無菌鋪單,以背部后正中線旁開1.5 cm,雙側肋緣下1 cm為切口,向下逐層切開1-1.5 cm,鈍性分離皮下組織肌肉,暴露腹腔,可見白色脂肪組織,輕柔提拉出脂肪,可見粉紅色桑葚狀的卵巢,輕柔分離卵巢下輸卵管與脂肪,用組織鉗夾閉卵巢下輸卵管,將輸卵管連同其周圍血管用外科縫線環(huán)形結扎,剪除卵巢,將斷端輸卵管送回腹腔,逐層縫合。同法切除另一側卵巢。碘伏再次消毒術口。于大鼠大腿肌肉內注射青霉素8萬IU。造模完畢。

1.4 改良式背側部正中單切口入路去卵巢手術

禁食麻醉固定同1.3敘述。以背部后正中線上平肋緣下1.5 cm處為中心點O,邊長2 cm正方形備皮剃毛,分別用碘伏和酒精于術部消毒(見圖1A),覆蓋無菌鋪單,于O點處縱向切口1.5-2 cm(見圖1B),拉動術區(qū)皮膚,將O點切口左側移1 cm,鈍性分離皮下組織肌肉,暴露腹腔,可見白色脂肪組織,輕柔提拉出脂肪,可見粉紅色桑葚狀的卵巢,輕柔分離卵巢下輸卵管與脂肪,用組織鉗夾閉卵巢下輸卵管,將輸卵管連同其周圍血管用外科縫線環(huán)形結扎(見圖1C),剪除卵巢,將斷端輸卵管送回腹腔,縫合肌肉一針。拉動術區(qū)皮膚,將O點切口右側移1 cm,同法切除右側卵巢?？p合術口皮膚。碘伏再次消毒術口。于大鼠大腿肌肉內注射青霉素8萬IU。造模完畢。

1.5 術后處理

術后前3 d每天肌注青霉素8萬IU/只。密切觀察術口及大鼠精神狀況。

A.確定O點 B.縱向切口1.5-2 cm C.結扎切除卵巢圖1 改良式背側部正中單切口入路去卵巢術Figure 1 Modified single incision dorsolateral median approach for ovariectomy

1.6 骨密度測量

選擇micro-CT對大鼠股骨樣本逐個掃描。樣本固定后,設置參數(shù):50 kV,500 μA,0.5 mm濾過濾器,952 ms曝光,像素尺寸8.89 μm,2幀平均,0.4°旋轉180°對股骨進行成像。掃描后應用micro-CT自帶分析軟件進行分析,以股骨內正中松質骨區(qū)域為圓心設置感興趣區(qū)域。計算相對骨體積(relative bone volume,BV/TV)。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 手術耗時

從切開皮膚開始計時,至術口縫合完畢計時終止。所有手術均由同一實驗人員完成。OVXD組與OVXS組手術平均時間分別(19.38±0.55)min和(15.10±0.51)min,背部單切口組比背部雙切口組手術用時平均縮短5 min(P<0.001,見圖2)。

2.2 術中出血量

手術出血量以紗布棉球術后與術前質量差值為標準。OVXD組與OVXS組平均出血量分別為(2.48±0.36)g和(2.44±0.40)g,兩組手術方式出血量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.83,見圖3)。

圖3 兩組大鼠出血量Figure 3 Comparison of blood loss between two groups

2.3 術中及術后1周內大鼠死亡情況

兩組大鼠術后均未出現(xiàn)死亡情況。

與OVXD組比較,**P<0.001圖2 兩組大鼠手術時間Figure 2 Comparison of operation time of rats between two groups

2.4 術后1周內術口開裂情況

術后1周內OVXD組與OVXS組大鼠術口開裂數(shù)量分別為4只和2只,術口開裂再次縫合線結數(shù)量分別為10個和4個。雙切口組大鼠術口開裂數(shù)量與單切口組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.628,見表1),但由于雙切口組多為一側術口或雙側術口開裂,其所需再次縫合的線結數(shù)量明顯高于單切口組。

表1 術后1周內大鼠術口開裂情況

2.5 術后老鼠術口感染數(shù)量

術后1周內OVXD組與OVXS組出現(xiàn)切口開裂、紅腫、膿性分泌物等感染跡象的大鼠數(shù)量分別為4只和2只,感染率分別為40%和20%。均予以再次縫合后單籠飼養(yǎng),并抗生素抗感染治療后康復。

2.6 術后2月造模成功率

術后2月OVXD組與OVXS組相對骨體積分別為21.828%±2.622%和19.185%±2.309%(P=0.867),sham組為40.316%±2.573%,兩種術式骨質疏松造模均成功,與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見圖4,5)。

與假手術組比較,**P<0.001圖4 術后2月各組大鼠骨密度評價Figure 4 Bone mineral density evaluation of rats in each group two months after operation

圖5 術后2月各組大鼠股骨遠端Micro-CTFigure 5 Micro-CT of distal femur in each group two months after operation

3 討論

骨質疏松已經成為世界性難題。骨質疏松癥因其所致并發(fā)癥骨質疏松性骨折而嚴重危害人群健康。骨質疏松癥以骨量低、骨組織微結構損壞而導致骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征,包括原發(fā)性骨質疏松和繼發(fā)性骨質疏松兩大類[9]。前者主要包括絕經后骨質疏松癥(Ⅰ型)、老年骨質疏松癥(Ⅱ型)和特發(fā)性骨質疏松癥,后者主要指由任何影響骨代謝的疾病和/或藥物及其他明確病因所誘發(fā)[2]。成骨細胞介導骨形成,破骨細胞介導骨吸收,兩者不斷更新并保持動態(tài)平衡,此過程即骨重建[10]。成骨細胞的骨形成功能和破骨細胞的骨吸收功能對維持骨重建的平衡起著決定性作用。當成骨細胞活性大于破骨細胞活性時,骨重建呈正平衡時,骨量增加;成骨細胞活性小于破骨細胞活性時,骨重建呈負平衡,將導致骨質疏松癥的發(fā)生[11]。絕經后骨質疏松癥一般發(fā)生在女性絕經后5-10年內,在我國,相比于男性,絕經后婦女有著更高的骨質疏松癥的發(fā)病率[12]。絕經后婦女卵巢功能衰退,循環(huán)雌激素水平急劇下降。雌激素是維持骨代謝平衡的重要物質之一,雌激素可通過RANKL/RANK/OPG途徑直接作用于破骨細胞,促使破骨細胞凋亡、抑制破骨細胞分化、成熟,從而使得骨吸收減少[13]。另外,雌激素通過改變轉錄因子的活性,調節(jié)自噬,減弱氧化應激反應,降低NF-κB活性,降低骨硬化蛋白,抑制成骨細胞凋亡并增加成骨細胞的存活時間,從而影響骨代謝,所以雌激素缺乏可引起骨代謝失衡,導致骨量減少或骨質疏松[14,15]。

有研究表明,絕經后患有骨質疏松的婦女,其總膽固醇和高密度脂蛋白(HDL)的水平明顯高于正常骨量的婦女,且膽固醇、HDL水平等與骨密度呈負相關[16]。深入研究發(fā)現(xiàn),骨髓腔內的脂肪細胞和成骨細胞均來源于骨髓間充質干細胞,兩者同宗同源,并且在一定條件下可以互相轉換[17-19]。絕經后骨質疏松癥為高轉換型骨質疏松,其形成由于成骨細胞的相對下降和破骨細胞的相對上升,在成骨與破骨的同時,使得骨量總體呈下降趨勢;而成骨細胞的形成減少,又與脂肪細胞的形成增多相偶聯(lián),哺乳動物骨髓腔中骨量減少的同時常伴隨著脂肪細胞的聚集,成骨/成脂分化表現(xiàn)出一定的“此消彼長”規(guī)律,故此骨髓中的脂肪細胞數(shù)量與松質骨的骨量成反比,骨量減少的同時,骨髓腔內脂肪細胞總是增多[20-22]。骨質疏松動物模型的成功建立對于研究骨質疏松發(fā)病機制、防治措施以及新藥研發(fā)等十分重要。如今有很多方法可以成功獲得骨質疏松動物模型,包括激素干預誘發(fā)的骨質疏松動物模型、局部廢用性骨質丟失動物模型、營養(yǎng)缺陷誘發(fā)的骨質疏松動物模型以及其他類型的骨質疏松動物模型(如維甲酸、鏈脲佐菌素、基因工程法誘導而成等)[23,24]。去勢(去卵巢)方法以其簡易便捷、安全可靠及耗費低廉等特點而應用廣泛,目前已被公認為最可靠的建模方式,而且FDA和WHO已經推薦去卵巢大鼠作為研究絕經后骨質疏松癥的經典模型[25,26]。去勢法排除雌激素干擾,與人絕經后骨質疏松癥患者十分相似,當前研究多使用3-10月齡未孕雌鼠,造模持續(xù)時間多為12-24周以建成絕經后骨質疏松模型[27-29]。去卵巢對大鼠體質量和能量代謝調節(jié)的影響和終身高脂飲食十分相似,卵巢切除術后神經免疫信號發(fā)生改變,神經免疫因子的動態(tài)選擇性變化導致脂肪形成增加,從而使得術后的大鼠普遍肥胖[30,31]。大量研究表明骨髓脂肪細胞和成骨祖細胞之間存在相互關系,脂肪生成越多,成骨生成越小,反之亦然[32]。正常成年雌性大鼠雌激素水平正常,而雌激素在身體對胰島素敏感性和腦氧化應激起著重要的作用,這也是卵巢切除后大鼠肥胖的另一原因[33]。

卵巢位于腰大肌外側緣,位置靠近背部,從背部開口容易找到卵巢。大鼠腹部經常接觸墊料,腹部開口法和腹股溝切口法的感染幾率較大,大鼠清醒后撓抓咬切口,容易咬斷縫合線使切口裂開,背部兩側切口感染幾率相對較小,但雙切口較為費力,兩側切口皆在背部肋緣下松軟處,大鼠皮韌堅厚,松軟處下刀,做切口稍顯費力,正中單切口法于脊背部正中下刀,切口方便簡單。經過對比,背部正中單切口組比背部雙切口組手術用時明顯縮短,原因考慮雙切口組需要多縫合一處等長切口,而縫合一處切口時間約為5 min。術后兩組大鼠術口開裂數(shù)量無顯著性差異,但由于雙切口組多為一側術口或雙側術口開裂,其所需再次縫合的線結數(shù)量明顯高于單切口組。相同暴露因素下,術口越多,術口開裂頻率越大,所需再次縫合線結數(shù)量愈多。背部正中單切口位置較高,大鼠爪牙難以觸及,大鼠為俯睡動物,感染風險亦相對降低。

綜上,背部正中單切口卵巢切除術的操作更為簡便,縮短手術時間,減少術后并發(fā)癥的發(fā)生,術后術口開裂頻率較低,所需再次縫合線結數(shù)量較少。提高大鼠骨質疏松造模安全性及減輕研究者術后再次縫合術口及處理其他并發(fā)癥的負擔。