靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞系VEGF對樹突狀細(xì)胞分化成熟及免疫功能的影響

匡穎

【摘 要】 目的：探討靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞系VEGF對樹體狀細(xì)胞（DC）分化成熟、免疫功能的影響。方法：設(shè)置含VEGF干擾序列慢病毒載體LV-VEGFA-RNAi的實驗組、不含有效感染VEGF的陰性對照組組及慢病毒載體命名LV-CON的空白對照組，分別對各組T24細(xì)胞進行感染，用流式細(xì)胞儀及顯微鏡對各組VEGF mRNA表達(dá)情況進行評價。結(jié)果：相較于空白及陰性對照組，實驗組T24細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)受明顯的抑制，熒光強度明顯。結(jié)論：靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞系VEGF表達(dá)可促進微環(huán)境DC成熟，提高免疫功能，修復(fù)DC被損傷的免疫功能及提高DC抗腫瘤能力。

【關(guān)鍵詞】 靶向沉默;膀胱癌;T24細(xì)胞系;血管內(nèi)皮生長因子;樹突狀細(xì)胞

【中圖分類號】 R737.14 ? 【文獻標(biāo)志碼】A ? 【文章編號】1005-0019（2020）17-252-02 ?膀胱癌為泌尿科常見的惡性腫瘤疾病，研究表明免疫逃逸為引起疾病發(fā)病及進展的重要機制。樹突狀細(xì)胞（DC）為腫瘤發(fā)病中常見的細(xì)胞受體，同時也在抗腫瘤免疫機制中也有重要作用[1]。血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）為膀胱癌中活性強的血管生成因子，研究表明腫瘤微環(huán)境中，VEGF會引起腫瘤患者外周血細(xì)胞或腫瘤組織中DC前體細(xì)胞的成熟度降低，而成熟DC的減少則可引起腫瘤免疫逃逸，由此推測多可有效抑制VEGF分泌則可增加成熟DC的數(shù)量，發(fā)揮抗腫瘤的效果[2]。本次研究中，探討借助RNAi技術(shù)構(gòu)建VEGF病毒干擾載體，借助靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞系VEGF表達(dá)對促進DC成熟數(shù)量增加及調(diào)節(jié)機體免疫功能的價值，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細(xì)胞系;人外周血單個核細(xì)胞;慢病毒干擾載體LV-VEGFA-RNAi、陰性對照載體LVCON;RNA提取試劑盒、PCR擴增物;人VEGF酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。

1.2 方法 （1）膀胱癌T24細(xì)胞感染。正式感染前依照比例計算病毒用量，人膀胱癌T24細(xì)胞根據(jù)實驗組（含有針對VEGF有效干擾序列的慢病毒載體命名的LV-VEGFA-RNAi）、陰性對照組（不含有效感染的VEGF）及空白對照組（慢性病毒載體命名為LV-CON）設(shè)置接種在12個孔板上，每孔均含0.5×105個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)基選擇體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1%雙抗RPMI-1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于溫度37℃及5%二氧化碳的孵箱中，3天后將培養(yǎng)基取出依照滴定測定的結(jié)果對各組T24細(xì)胞做慢病毒感染，12h更換培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察病毒的感染效率，待各組細(xì)胞增殖感染后4d提取RNA，測定各組VEGF mRNA表達(dá)水平。（2）T24細(xì)胞上清、DC培養(yǎng)。應(yīng)用100ng/ml含rh的GM-CSF、100ng/ml含rh 的IL-4，接種在1640培養(yǎng)基上，對應(yīng)前面的T24細(xì)胞分組，置于孵箱中培養(yǎng)到第4d、6d，在培養(yǎng)基上加入90%匯合度的培養(yǎng)上清，培養(yǎng)至14d是收集成熟DC，分別用鼠抗人CD1a、CD83、CD86單克隆抗體進行染色及流式細(xì)胞分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件做統(tǒng)計學(xué)結(jié)果分析，計量資料用t檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染T24細(xì)胞 實驗組在營養(yǎng)強度上顯著高于陰性與空白對照組，但是陰性及空白對照組在熒光強度上組間無顯著差異。在VEGF mRNA表達(dá)上，實驗組表達(dá)水平明顯較對照組更低，而對照組間無顯著差異，詳見表1。

2.2 T24細(xì)胞上清及DC共培養(yǎng)結(jié)果 T24上清同未成熟DC共培養(yǎng)第14d，顯微鏡下顯示實驗組DC變大或變圓，出現(xiàn)明顯毛刺，屬成熟的DC特征;陰性與空白對照DC的多呈半貼壁情況，毛刺不顯著，成熟度均較實驗組更低。

3 討論

DC為腫瘤環(huán)境中功能強大的細(xì)胞，可激活T淋巴細(xì)胞對特異性抗原的免疫應(yīng)答能力。DC分為成熟與未成熟兩種形態(tài)，成熟形態(tài)的DC小且圓，鏡下呈葡萄樣集簇，表面光滑[3]。對膀胱癌這一惡性腫瘤疾病，DC成熟明顯受抑制，成熟DC具有顯著的呈遞抗原能力及活化T細(xì)胞能力，然而VEGF則會將DC抑制在未成熟的狀態(tài)，讓DC只具備加工以及處理抗原的能力，無法發(fā)揮呈遞抗原以及活化T細(xì)胞的能力，這使得DC抗腫瘤效應(yīng)無法正常發(fā)揮。

絕大多數(shù)的癌癥病患有分泌VEGF的能力，且腫瘤組織、血清中均可檢出VEGF異常增高情況，膀胱癌雖然為下段癌癥也同樣存在VEGF明顯增高的情況。腫瘤患者中，機體分泌的VEGF大量分泌可誘導(dǎo)DC的分化及成熟，引起DC凋亡，這樣會阻止DC抗原呈遞，引起腫瘤免疫逃逸。在本次實驗中，設(shè)計病毒干擾T24細(xì)胞，研究中進行了分組，結(jié)果顯示同空白及陰性對照組組別比較，實驗組在VEGF mRNA表達(dá)上明顯更低，且DC表現(xiàn)多為圓形及毛刺樣，這證實T24細(xì)胞分泌VEGF會抑制微環(huán)境中DC分化及成熟。

綜上所述，對膀胱癌這一惡性腫瘤疾病，對VEGF作用DC途徑的干擾，可明顯增加腫瘤微環(huán)境中的DC成熟度，讓DC免疫功能修復(fù)提高，并提高DC疫苗療效，這為膀胱癌的臨床治療提供有利參考。

參考文獻

[1] 陳爍， 龔銀銀， 顏景穎， 等. CXCR4基因沉默對膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡及遷移能力的影響[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2019，15（3）：102.

[2] 王俊霖， 楊勇， 陳從波， 等. 絲氨酸蛋白酶抑制劑B3基因沉默對膀胱癌T24細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷移的影響[J]. 中華實驗外科雜志， 2018， 35（6）：1166-1166.

[3] 龐昆， 李美麗， 陳波，等. ERH基因?qū)θ税螂装㏕24和5637細(xì)胞遷移、侵襲的影響[J]. 中國醫(yī)師雜志， 2019， 21（6）：856-861.