山銀花葉中綠原酸的提取分離純化方法研究

袁詠紅　陳志元　王玉

摘要 ? ?本文以山銀花葉為試驗材料，通過正交試驗優(yōu)選出綠原酸最佳提取方法;使用大孔樹脂對提取液進(jìn)行粗分離，優(yōu)化大孔樹脂型號、上樣液pH值、樹脂對綠原酸的飽和吸附量及樹脂洗脫條件;在乙酸乙酯純化工藝中，考察萃取時間、萃取劑用量、萃取料液濃度、萃取次數(shù)，得到最佳萃取工藝。結(jié)果表明，在所確定的最佳提取、分離、純化條件下，綠原酸純度可達(dá)到95%以上（HPLC）。該提取分離純化方法對山銀花葉中有效成分綠原酸的提取率高、穩(wěn)定性好，生產(chǎn)成本低廉，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，是一種較好的高含量綠原酸提取物制備工藝。

關(guān)鍵詞 ? ?山銀花葉;綠原酸;提取;分離;純化

中圖分類號 ? ?R284.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）16-0195-03

Study ?on ?Extraction， Separation ?and ?Purification ?of ?Chlorogenic ?Acids ?from ?Leaves ?of ?Lonicera ?confusa

YUAN Yong-hong ? ?CHEN Zhi-yuan ? ?WANG Yu

（Jing Brand Chizhengtang Pharmaceutica Co.， Ltd.， Huangshi Hubei 435000）

Abstract ? ?The optimum extraction method of chlorogenic acid was selected by orthogonal test with Lonicera confusa leaves as the test materials. Macroporous resin was used to roughly separate the extract and optimize the type of macroporous resin， the pH value of sample solution， the saturated adsorption capacity of resin to chlorogenic acid and the resin elution conditions. In the purification process of ethyl acetate， the extraction time， the amount of extractant， the concentration of extractant solution and the extraction times were investigated， the best extraction process was got. The results showed that under the optimum conditions of extraction， separation and purification， the purity of chlorogenic acid could reach more than 95% （HPLC）. The extraction， separation and purification method had high extraction rate， good stability， low production cost， and was suitable for industrial production. It was a better preparation process of chlorogenic acid extract with high content.

Key words ? ?Lonicera confusa leaves; chlorogenic acid; extraction; separation; purification

山銀花名大銀花，為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera confuse DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomintosa Hsu et S. C. Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效，用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒及溫?zé)岚l(fā)病等[1]。山銀花中含有揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)酸、酯類等多種化學(xué)成分[2-4]。其主要有效成分是綠原酸，是一種苯丙素類化合物，該成分易溶于水和乙醇。研究表明，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗白血病、降脂、降糖等作用[2-4]。近年來，山銀花在醫(yī)藥、保健食品等領(lǐng)域的消耗量逐年增加，市場供不應(yīng)求，但其莖葉未得到有效利用，造成較大的資源浪費。研究表明，山銀花莖葉中也含有豐富的綠原酸，可作為提取綠原酸的原料[5-6]。目前，綠原酸的提取方法主要有水煎煮、回流醇提、微波提取、閃式提取、超臨界萃取等[7-10]。雖然微波提取、閃式提取、超臨界萃取等方法較優(yōu)于常用的回流提取、水煎煮方法，但是這些設(shè)備價格比較昂貴，適合大型生產(chǎn)的設(shè)備不多，在實際生產(chǎn)中應(yīng)用較少。本研究以山銀花葉為原料，設(shè)計了水和乙醇提取綠原酸的工藝優(yōu)化試驗，使山銀花葉中的綠原酸被充分提取出來，利用常用到的大孔樹脂結(jié)合乙酸乙酯萃取方法對提取液進(jìn)一步分離和純化，最后通過結(jié)晶和重結(jié)晶使綠原酸純度達(dá)到95%以上（HPLC）。建立了一種生產(chǎn)成本低廉、易操作、無毒無害、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的高純度綠原酸提取制備工藝。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）、XS105型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、JJ1000A型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、HH-4型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

AB-8大孔樹脂、D101大孔樹脂、LS303大孔樹脂，購自陜西藍(lán)曉科技有限公司;綠原酸對照品，購于中國食品藥品檢定研究院;山銀花葉，購于湖北正光九資河藥業(yè)公司;食用酒精，純凈水。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?綠原酸含量測定方法。 樣品中綠原酸含量均參照《中國藥典》2015版“金銀花含量測定”項的方法進(jìn)行。色譜條件：C18柱，乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）為流動相，檢測波長327 nm。

1.2.2 ? ?正交試驗法提取綠原酸。選擇提取溶劑、提取溫度、提取時間、提取溶劑倍數(shù)為考察因素，提取次數(shù)固定為2次，選擇4因素3水平正交表進(jìn)行正交試驗，選擇最佳提取條件。試驗因素及水平見表1。

1.2.3 ? ?大孔樹脂吸附分離綠原酸。1BV表示1倍柱體積，1BV/h表示1 h 1倍柱體積。

（1）大孔樹脂的預(yù)處理。將大孔樹脂用95%乙醇浸泡4 h以上，去除雜質(zhì)，濕法上柱，再用純凈水沖洗至流出液澄清且無乙醇味，待用。

（2）大孔樹脂型號選擇。分別稱取AB-8型號、D101型號、LS303型號樹脂各100 g，進(jìn)行預(yù)處理，濕法裝柱。取3份各50 g山銀花葉在最佳提取條件下制備得到的提取液進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附流速為2.0 BV/h，收集流出液，測定其中綠原酸含量，計算比吸附量，公式如下：

比吸附量=（吸附前藥液中綠原酸質(zhì)量-流出藥液中綠原酸質(zhì)量）/樹脂量

（3）上樣液pH值的優(yōu)化。分別稱取AB-8型號樹脂3份，每份100 g，按照1.2.3（1）中描述進(jìn)行處理。分別取3份50 g山銀花葉在最佳提取條件下制備得到提取液，將提取液分別調(diào)節(jié)pH值至3、5、7，以2 BV/h速度進(jìn)行吸附，收集流出液，并測定其中綠原酸含量，計算不同pH值下樹脂的比吸附量。

（4）AB-8樹脂對綠原酸飽和吸附量的優(yōu)化。2組AB-8型號樹脂預(yù)處理后串聯(lián)使用，每組樹脂裝量為50 g，稱取150 g山銀花葉子按最佳提取條件提取，提取液調(diào)節(jié)pH值至3后過串聯(lián)樹脂，依次用4 BV水和20%乙醇依次洗脫，用乙醇解吸時2根樹脂的解吸液分開收集，測定第1根解吸液中綠原酸含量，計算樹脂最大吸附量為22.7 mg/g。

（5）洗脫溶劑的優(yōu)化。稱取100 g山銀花葉按最佳提取條件提取，提取液調(diào)至pH值至3后過100 g AB-8樹脂，依次用4 BV水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇洗脫，上柱、洗脫速度均為2 BV/h。

（6）洗脫溶劑用量的優(yōu)化。稱取100 g山銀花葉，按最佳提取條件進(jìn)行提取，提取液調(diào)節(jié)pH值至3后過柱，依次水洗脫、20%乙醇洗脫，洗脫液均每1 BV收集1次，測定各組中綠原酸含量。

1.2.4 ? ?乙酸乙酯對綠原酸的純化。

（1）萃取溶液的配制。稱取約20 g上述樹脂分離純化得到的綠原酸提取物，加水200 mL，使溶解得到萃取溶液。

（2）萃取時間的優(yōu)化。量取1.2.4（1）中溶液10 mL/組于分液漏斗中，共5組，加入10 mL乙酸乙酯，萃取5、10、15、20、30 min，每組萃取2次，靜置分層后收集上層乙酸乙酯相，合并2次有機(jī)相，測定有機(jī)相中綠原酸含量。

（3）萃取溶劑用量的優(yōu)化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/組于分液漏斗中，共5組，加入5、10、20、30、40 mL乙酸乙酯，萃取2次，每次20 min，合并2次有機(jī)相，測定有機(jī)相中綠原酸含量。

（4）萃取原液濃度的優(yōu)化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/組于分液漏斗中，共4組，其中2#、3#、4#組分別加入純凈水5、10、15 mL，再加入等量體積的乙酸乙酯萃取2次，合并2次有機(jī)相，測定有機(jī)相中綠原酸含量。

（5）萃取溫度的優(yōu)化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/組于分液漏斗中，共5組，分別在25、35、45、55、65 ℃水浴鍋中萃取15 min，萃取1次，立即將溶液倒入分液漏斗中，測定有機(jī)相中綠原酸含量。

（6）萃取次數(shù)的優(yōu)化。量取50 mL綠原酸濃度10 mg/mL的溶液，加入200 mL乙酸乙酯，25 ℃萃取20 min，共萃取6次，每次萃取得到的有機(jī)相單獨收集并測定其中綠原酸含量，計算萃取率。

（7）結(jié)晶。將乙酸乙酯萃取得到的有機(jī)溶液揮干，加入純凈水進(jìn)行結(jié)晶，用純凈水洗滌結(jié)晶3次，低溫干燥到白色粉末。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?正交試驗法提取綠原酸

由表2可知，各因素對綠原酸提取率影響主次為提取溫度>提取溶劑>提取時間>提取料液比，最佳提取條件組合為A1B2C2D1，即以綠原酸提取率為指標(biāo)的最佳提取條件為用水作提取劑、80 ℃、提取1.5 h、料液比1∶18、提取2次。

2.2 ? ?大孔樹脂吸附分離綠原酸

3種型號樹脂的比吸附量分別為6.60、4.72、2.79 mg/g，故選擇AB-8型號樹脂。不同pH值下樹脂的比吸附量分別為12.71、6.65、5.95 mg/g，故選擇將上樣液pH值調(diào)至3。由表3可知，結(jié)合綠原酸純度及洗脫比，用20%乙醇洗脫較佳。由表4可知，水洗可除去部分雜質(zhì)，但洗脫量太大也會造成綠原酸的損失，結(jié)合洗脫液顏色及浸膏量確定選用2 BV，20%乙醇下的綠原酸主要集中在前6 BV，故選用6 BV的20%乙醇洗脫。綜上所述，AB-8型號樹脂分離綠原酸的最佳條件為：上柱液pH值調(diào)至3，樹脂對綠原酸的最大吸附量為22.7 mg/g，洗脫條件為先用2 BV水，再用6 BV 20%乙醇，吸附劑洗脫速度均為2 BV/h。

2.3 ? ?乙酸乙酯對綠原酸的純化

如表5～9所示，乙酸乙酯萃取綠原酸的最佳萃取參數(shù)為：綠原酸溶液濃度為10 mg/mL，25 ℃下萃取3次，每次乙酸乙酯用量為4倍溶液體積，萃取時間為20 min，經(jīng)驗證綠原酸萃取率可達(dá)到95%。

3 ? ?結(jié)論與討論

山銀花葉中綠原酸的提取受多種因素的影響，本研究主要針對提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比等4個方面對綠原酸的提取率進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，采用水為提取溶劑，80 ℃提取2次，每次提取1.5 h，山銀花葉中綠原酸提取率最高，綠原酸轉(zhuǎn)移完全。采用水提取方法所用溶劑為水，安全易得，不存在易燃易爆危險，成本相對低廉、環(huán)保。

在綠原酸粗品制備工藝中，使用常見的大孔樹脂在弱酸性條件下對綠原酸進(jìn)行分離純化，該工藝?yán)昧司G原酸是多羥基酚酸，在酸性條件下（pH值2～3）以分子形式存在、疏水性強(qiáng)、易被樹脂吸附這一特點。在綠原酸精制工藝中，使用乙酸乙酯進(jìn)一步純化綠原酸，再用水進(jìn)行結(jié)晶，綠原酸轉(zhuǎn)移率高、純度高、乙酸乙酯和水安全性高、成本低廉。

總之，本方法以山銀花葉為原料，采用水提取，大孔樹脂分離，乙酸乙酯及水純化和結(jié)晶，整個工藝生產(chǎn)原料價格低廉，易獲得，安全性高，工藝簡單，是制備高純度綠原酸的優(yōu)良方法，非常適用于工業(yè)生產(chǎn)。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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作者簡介 ? 袁詠紅（1986-），女，湖北黃石人，中級工程師。研究方向：天然藥物化學(xué)。

收稿日期 ? 2020-04-28