脊髓損傷對下丘腦c-Fos表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響

孫鵬　葉祥明　田亮　李厥寶　程瑞動

[摘要] 目的 探討脊髓損傷后下丘腦神經(jīng)細胞凋亡情況，確認脊髓損傷導(dǎo)致大腦損害的特點及其在相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的可能機制。 方法 18只SD大鼠隨機分為兩組：假模組（Sham組）和脊髓損傷組（SCI組），以改良的Allens撞擊法制作脊髓損傷動物模型，常規(guī)飼養(yǎng)，分別于8周取大鼠下丘腦組織，應(yīng)用免疫熒光染色法觀察脊髓損傷大鼠下丘腦組織c-Fos表達，TUNEL法觀察兩組下丘腦神經(jīng)細胞凋亡情況，應(yīng)用ELISA法檢測兩組大鼠下丘腦炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達。 結(jié)果 脊髓損傷后8周，SCI組較Sham組下丘腦c-Fos表達明顯增加（P<0.05），同時下丘腦可見明顯凋亡細胞，主要表現(xiàn)為胞漿減少，細胞核深染、固縮在一邊;SCI組TUNEL陽性細胞數(shù)比Sham組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;SCI組大鼠下丘腦包括TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥因子水平較Sham組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 脊髓損傷可對下丘腦造成損害，表現(xiàn)為下丘腦神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應(yīng)明顯增加，其可能與c-Fos表達有關(guān)，脊髓損傷后對下丘腦的損害可能是某些并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機制。

[關(guān)鍵詞] 脊髓損傷;下丘腦;c-Fos;神經(jīng)細胞凋亡;炎癥反應(yīng)

[中圖分類號] R651.2 ? ? ? ? ?[文獻標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）21-0045-04

Effect of spinal cord injury on the expression of c-Fos in hypothalamus and neuronal apoptosis

SUN Peng YE Xiangming TIAN Liang LI Juebao CHENG Ruidong

Department of Rehabilitation Medicine， Zhejiang Provincial People's Hospital， People's Hospital of Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the neuronal apoptosis of hypothalamus after spinal cord injury， and to confirm the characteristics of spinal cord injury leading to brain damage and its possible mechanism in the occurrence and development of related complications. Methods 18 SD rats were randomly divided into two groups including sham module （Sham group） and spinal cord injury group（SCI group）. The animal model of spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. And the rats were conventionally fed. Rat hypothalamus tissues were taken at the 8th week. The expression of c-Fos in the hypothalamus of spinal cord injury rats was observed by immunofluorescence staining. The neuronal apoptosis of hypothalamus in the two groups was observed by TUNEL method. The expressions of hypothalamic inflammatory factors（TNF-α， IL-1β， IL-6） of two groups were detected by ELISA method. Results Eight weeks after spinal cord injury， the expression of c-Fos in the hypothalamus of the SCI group was significantly higher than that of the Sham group（P<0.05）. At the same time， there were obvious apoptotic cells in the hypothalamus. The main manifestations werecytoplasm reduction， nucleus deep staining and shrinkage of the nucleus on one side. The number of TUNEL positive cells in the SCI group was significantly higher than that in the Sham group（P<0.01）. The levels of various inflammatory factors in the hypothalamus of the SCI group， including TNF-α， IL-1β， IL-6， were higher than those in Sham group， and the difference between the two groups was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Spinal cord injury can cause damage to the hypothalamus， which is manifested by a marked increase in neuronal apoptosis and inflammatory response. This may be related to the expression of c-Fos. The damage of spinal cord injury to the hypothalamus may be the pathogenesis of the development of certain complications.

[Key words] Spinal cord injury; Hypothalamus; c-Fos; Neuronal apoptosis; Inflammatory response

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）造成脊髓連續(xù)性結(jié)構(gòu)和功能的破壞，切斷了大腦與脊髓之間的聯(lián)系，導(dǎo)致?lián)p傷平面以下運動和感覺功能的障礙及多種代謝紊亂，SCI中斷了大腦與脊髓之間的反饋，致使損傷后的脊髓長期處于異常的應(yīng)激狀態(tài)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后腦部能夠發(fā)生廣泛而持續(xù)的炎癥，造成神經(jīng)細胞逐漸凋亡，導(dǎo)致患者認知障礙和精神障礙疾病的出現(xiàn)[3-4]，神經(jīng)系統(tǒng)中，c-Fos基礎(chǔ)表達水平很低，不易被檢測到，只有在神經(jīng)系統(tǒng)受到炎癥因子刺激時才被激活，繼而合成c-Fos蛋白。c-Fos的表達與神經(jīng)細胞的凋亡關(guān)系密切[5]，下丘腦是調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的樞紐，是應(yīng)激反應(yīng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)控著人體諸如體溫、攝食、激素水平、血糖和內(nèi)分泌腺活動等重要的基本生理功能，下丘腦損傷被認為是部分情緒障礙疾病及代謝性疾病發(fā)病的腦內(nèi)重要機制之一[6-8]，目前尚無研究報道脊髓損傷是否會對下丘腦造成損害，本研究旨在研究脊髓損傷后，下丘腦c-Fos的表達、神經(jīng)細胞凋亡及炎癥發(fā)生情況，明確脊髓損傷后對下丘腦的影響，為探討脊髓損傷內(nèi)分泌及代謝性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的可能機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

納入18只健康SD大鼠（6～8周齡，雄性，體重150～180 g，普通級，由上海斯萊克實驗動物中心提供，經(jīng)浙江省人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)）為研究對象，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機分為假模組（Sham組）和脊髓損傷組（SCI組），每組各9只。普通飼料組進食國家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料，每日自由飲水。采用改良Allens法制備脊髓不完全性損傷大鼠模型，具體方法見模型制備介紹，Sham組實施相同的手術(shù)過程但不進行打擊造成脊髓損傷。

1.2 脊髓損傷模型制備

SCI動物模型制備采用改良的Allens撞擊法[7]。腹腔注射5%水合氯醛[國藥集團（10009218）（300 mg/kg）體重]麻醉大鼠，背部剃毛后消毒，棘突定位后，以T10為中心作長約3 cm皮膚切口，鈍性剝離脊旁肌肉暴露脊椎，微型咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓，以上操作過程需特別注意硬脊膜完整。使用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）精確撞擊（10 g，25 mm），造成脊髓不完全損傷。模型成功標(biāo)志：出現(xiàn)大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢軀體回縮樣撲動，脊髓打擊部位淤血，雙下肢馳緩性癱瘓。手術(shù)結(jié)束后，逐層縫合切口，消毒表皮。術(shù)后注意保溫，單籠飼養(yǎng)，一日2次手工擠壓膀胱幫助排尿，并保持小鼠身體干燥，每日測量體重，給予自由攝食與飲水，飼養(yǎng)8周后行后續(xù)試驗。

1.3 組織切片制備

大鼠飼養(yǎng)8周后斷頭處死，冰上快速取腦組織并分離出下丘腦。將分離腦組織固定于4%多聚甲醛中[國藥集團（10009218）]24 h。隨后將目的部位腦組織修平整后放于脫水盒內(nèi)。①脫水：將腦組織分別放進不同酒精濃度的脫水盒里進行脫水：50%酒精0.5 h→60%酒精0.5 h→75%酒精0.5 h→85%酒精0.5 h→90%酒精0.5 h→95%酒精0.5 h→無水乙醇I 0.5 h→無水乙醇Ⅱ 0.5 h→二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→蠟Ⅰ 0.5 h 62℃→蠟Ⅱ 0.5 h 62℃→蠟Ⅲ 0.5 h 62℃。②包埋：包埋機內(nèi)包埋浸好蠟的腦組織，首先將融化的蠟放入包埋框，將組織從脫水盒內(nèi)取出，在蠟塊凝固之前按照包埋面的要求放入包埋框，并貼上對應(yīng)的標(biāo)簽，然后將蠟塊置于-20℃冷凍臺冷卻，待蠟?zāi)毯笕〕霾⑿拚瀴K。③切片：將修整好的蠟塊置于切片機（德國徠卡公司）上切片，厚度7 μm。切片漂浮于攤片機將組織展平，用載玻片將其撈起，并放進62℃烘箱內(nèi)烤片。待水烤干蠟烤化后取出常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫熒光染色

將組織沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)，脫水、浸蠟、包埋、切片，切片脫蠟后抗原修復(fù)，后PBS沖洗3次，每次5 min，加入兔抗大鼠c-Fos抗體（1：2000）（ThermoFisher，OSR00004W），4℃過夜避光孵育，次日復(fù)溫30 min，PBS洗3次，5 min/次，加入羊抗兔熒光二抗（Proteintech，USA），37℃培養(yǎng)30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAPI[Affinity（DF7097）]染色5 min，PBS洗3次，5 min/次，在顯微鏡上觀察。

1.5 TUNEL染色

TUNEL試劑盒購于瑞士Roche Applied Science（11684817910）。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 30 min→二甲苯Ⅱ 30 min→無水乙醇Ⅰ10 min→無水乙醇Ⅱ5 min→95%酒精5 min→90%酒精5 min→80%酒精5 min→70%酒精5 min→蒸餾水洗。PBS洗3次，每次5 min。將ProteinK200×儲液用TBS稀釋成1×的工作液，每張玻片加100 μL用濕盒孵育放在37℃ 培養(yǎng)箱15 min。切片浸入PBS 5 min每次洗3遍，每張切片取1 μL TDT和1 μL DIG-dUTP到18 μL Labeling Buffer里面混勻，TDT酶反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用。每張切片滴加20 μL TDT酶反應(yīng)液，放入濕盒中，37℃孵育2 h。PBS洗3次，每次5 min，每張玻片滴加50 μL封閉液，室溫孵育30 min。切片不洗滌，直接棄去封閉液，一抗用稀釋液1：100的稀釋，每張切片滴加100 μL生物素標(biāo)記的一抗。37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗用稀釋液1：100的稀釋，每張玻片滴加50 μL。37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，注意避光操作，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照存留。

1.6 ELISA法檢測各組大鼠下丘腦炎癥因子表達

標(biāo)準(zhǔn)品[ELSA試劑盒（Neobioscience，China）]按照說明書進行稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液加入空白孔，標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入其余相應(yīng)孔內(nèi)，將反應(yīng)孔用封板膠紙封住，放入36℃孵育箱內(nèi)孵育90 min;洗板后抗體稀釋液加入空白孔內(nèi)，抗體工作液（100 μL/孔）加入其余孔內(nèi)，避光孵育。酶結(jié)合物工作液避光室溫放置，將酶結(jié)合物稀釋液加入空白孔，酶結(jié)合物工作液（100 μL/孔）加入其余孔，避光孵育30 min;洗板5次，加入100 μL/孔顯色底物，36℃孵育箱避光孵育15 min，最后加入終止液100 μL/孔，混勻后即刻測量OD450值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

圖像分析采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件，每只大鼠選取3張切片，每張切片在損傷區(qū)隨機采集5個高倍視野。采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷后一般情況觀察

模型制備大鼠打擊后可見尾巴痙攣性擺動，雙下肢軀體回縮樣撲動，脊髓打擊部位可見淤血。待大鼠蘇醒后，發(fā)現(xiàn)動物靜臥少動，氣息微弱，食欲減退，數(shù)小時后可發(fā)現(xiàn)大鼠雙后肢感覺遲鈍、運動功能喪失，呈雙下肢拖地爬行。

2.2 脊髓損傷后下丘腦c-Fos表達

脊髓損傷后8周，由封三圖5A中可以看出，c-Fos主要表達于胞漿;相比Sham組（0.22±0.03），SCI組（0.29±0.04）大鼠下丘腦組織中c-Fos明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明脊髓損傷對大鼠下丘腦組織中c-Fos表達有著重要影響，見封三圖5B。

2.3 脊髓損傷后下丘腦神經(jīng)細胞凋亡

脊髓損傷8周后，光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Sham組表達少量陽性細胞，SCI組可見大量表達陽性細胞，主要表現(xiàn)為胞漿減少，細胞核深染、固縮在一邊（陽性結(jié)果為綠色的圓形顆粒狀細胞），見封三圖6A;SCI組（11.46±0.14）TUNEL細胞凋亡指數(shù)比Sham組（8.02±0.28）明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見封三圖6B。

2.4 兩組大鼠下丘腦炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）水平變化

為觀察SCI大鼠下丘腦炎癥反應(yīng)情況，采用ELISA法檢測兩組大鼠多種促炎細胞因子的水平，結(jié)果表明：脊髓損傷后，與Sham組比較，SCI組大鼠下丘腦中的多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

3 討論

SCI患者全世界數(shù)百萬人，這些患者大部分終身殘疾[9]。脊髓中存在運動和感覺的傳導(dǎo)束及下行運動神經(jīng)元，脊髓損傷后會擾亂神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的聯(lián)系及通訊，導(dǎo)致基本神經(jīng)功能的喪失和肢體癱瘓，不僅會給患者本人帶來生理和心理上的極大傷害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會對家庭乃至整個社會造成巨大的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，美國每天大約有30人診斷為脊髓損傷[10]。這些年來，SCI基礎(chǔ)與臨床的研究不斷進展，其臨床治療也取得了飛速發(fā)展，其中包括細胞治療[11-12]、基因治療等[13-14]。Wagner FB等[15]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者在接受定向脊髓刺激后能夠再次行走，是一項巨大突破，但是患者想要達到功能的完全康復(fù)仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，SCI后多發(fā)的并發(fā)癥嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1-2]，這其中包括肌肉萎縮、慢性疼痛、尿路感染和壓瘡等[16]。SCI的繼發(fā)性改變很難完全依靠局部的機制來解釋，因此神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境受刺激后的改變等所產(chǎn)生的炎癥等方面的作用已日漸受到重視。SCI后由于上行感覺纖維和下行運動傳導(dǎo)束的中斷，破壞脊髓與大腦的生理聯(lián)系，導(dǎo)致脊髓和腦部功能之間關(guān)聯(lián)的損害，之前大部分針對脊髓損傷的研究均集中于揭示脊髓損傷所引發(fā)的癥狀及并發(fā)癥，忽視了SCI對大腦所引發(fā)的效應(yīng)，已有研究顯示SCI可引起腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化，導(dǎo)致腦內(nèi)發(fā)生慢性炎癥過程[17-18]。Felix MS等[19]也發(fā)現(xiàn)，SCI不僅引起脊髓細胞的凋亡和死亡，在大腦皮質(zhì)和海馬中也引起該部位神經(jīng)細胞的凋亡。Wu J等[20]一項研究也證實SCI會引起關(guān)鍵大腦區(qū)域神經(jīng)細胞的逐漸受損，存在持續(xù)退化過程，這些損傷包括炎癥、神經(jīng)細胞缺失及其并發(fā)的認知力下降及損傷后的精神癥狀。

下丘腦-垂體-腎上腺軸是體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)系統(tǒng)，下丘腦軸在由神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)所介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角包。下丘腦既可以接受末端信息，又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，構(gòu)成了下丘腦-垂體-腎上腺軸核心，而且是神經(jīng)系統(tǒng)高級整合中樞，對實現(xiàn)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有著十分重要的作用，SCI后下丘腦也是其中易受影響的神經(jīng)核團之一[21]，徐又佳等[22]研究發(fā)現(xiàn)SCI影響正常神經(jīng)信號在大腦中樞傳導(dǎo)，下丘腦室旁核、視上核可產(chǎn)生明顯反應(yīng)，因此明確SCI是否對下丘腦造成損害對研究SCI后內(nèi)分泌及代謝相關(guān)并發(fā)癥尤為重要。針對SCI后可能對下丘腦造成的損害，本研究通過觀察SCI大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后可見明顯凋亡細胞，與對照組比較神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯增多，同時為觀察SCI大鼠下丘腦炎癥反應(yīng)情況，采用ELISA法檢測了兩組大鼠多種促炎細胞因子的水平，結(jié)果表明脊髓損傷后下丘腦中的多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，說明脊髓損傷可導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)細胞凋亡，并增加其炎癥反應(yīng)。當(dāng)細胞受刺激時如缺血、缺氧、損傷等情況，其核內(nèi)的c-Fos原癌基因被激活并表達蛋白，目前認為在細胞凋亡過程中適度的c-Fos蛋白表達參與了DNA的損傷修復(fù)，而進一步的表達增加將干預(yù)修復(fù)功能并使細胞凋亡，在某些情況下c-Fos表達是引導(dǎo)細胞凋亡基因調(diào)控通路中的一個必需成分，c-Fos蛋白的表達與凋亡有必然的聯(lián)系，中斷了細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)而誘導(dǎo)凋亡[23]，本研究中觀察到脊髓損傷后下丘腦c-Fos表達明顯增加，c-Fos的過度表達可能是導(dǎo)致脊髓損傷后下丘腦細胞凋亡的原因之一。本研究中選取的時間點為脊髓損傷8周后，說明急性期的應(yīng)激反應(yīng)后SCI仍對下丘腦造成持續(xù)性的慢性損害，臨床觀察中脊髓損傷容易存在合并精神癥狀及代謝性疾病的可能，脊髓損傷對下丘腦的損害可能是其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的致病機制，這尚待進一步研究。

綜上所述，脊髓損傷可對下丘腦造成損害，表現(xiàn)為下丘腦神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應(yīng)明顯增加，其可能與c-Fos表達有關(guān)，脊髓損傷后對下丘腦的損害可能是某些并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機制。

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（收稿日期：2020-01-10）