當(dāng)歸多糖對腦缺血再灌注損傷大鼠IL?1β、TNF?α、NF?κB 表達(dá)的影響

代 震 朱 昱 王治陽

（1.河南省中醫(yī)藥研究院， 河南鄭州450004； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南鄭州450008）

腦血管意外是危害我國老年群體的常見疾病之一，近年來腦血管疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，這與我國老年化進(jìn)程加快息息相關(guān)［1］。缺血性腦血管疾?。╥schemic cerebral vascular disease，ICVD） 是腦血管意外中第1 位致殘性疾病，患者可出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動、感覺障礙；同時(shí)也是第2 位致死性疾?。?］。目前對缺血性腦血管疾病治療包括超早期溶栓治療、抗凝治療、抗血小板治療、介入治療（腦血管內(nèi)）、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)治療以及外科手術(shù)（大面積腦梗死標(biāo)準(zhǔn)去骨瓣減壓術(shù)） 等［3］。早期溶栓治療后缺血區(qū)腦組織恢復(fù)供血的過程又稱之為“再灌注”，此時(shí)患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況極大影響預(yù)后［4］。本研究以腦缺血再灌注損傷大鼠為模型，探討不同劑量當(dāng)歸多糖對大鼠神經(jīng)功能和炎癥因子等影響。

1 材料

1.1 動物 健康清潔級SD 大鼠60 只，雄性，體質(zhì)量（210±20） g，購自河南中科聯(lián)創(chuàng)檢測服務(wù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK （豫） 2017?0027。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人負(fù)責(zé)管理。實(shí)驗(yàn)室定期消毒，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（HNZYYYJ2017?0012），符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

1.2 儀器 線栓（廣州佳靈生物科技有限公司）；MH550冰凍切片機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；光學(xué)顯微鏡（洛陽惠爾納米科技有限公司）；組織搗碎勻漿機(jī)（天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司）；臺式離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；自動酶標(biāo)儀（昆山吉和力儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備儀器公司）。

1.3 藥物與試劑 當(dāng)歸多糖（Angelica sinensis polysaccha?ride，ASP） 購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司［甘肅岷縣當(dāng)歸提取，批號CY150407，純度≥98%，組分主要包含半乳糖（35%）、阿拉伯糖（30%）、葡萄糖（21%）］；水合氯醛（武漢華申化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；IL?1β、TNF?α 檢測試劑盒（美國RD 公司）；NF?κB、GAPDH 一抗購于美國Cell Signaling 公司。

2 方法

2.1 分組 將飼養(yǎng)1 周后的大鼠稱定質(zhì)量后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、當(dāng)歸多糖低劑量組（30 mg／kg）、當(dāng)歸多糖中劑量組（45 mg／kg）、當(dāng)歸多糖高劑量組（60 mg／kg），每組12 只。預(yù)給藥14 d，當(dāng)歸多糖低、中、高劑量組灌胃給藥，1 次／d。假手術(shù)組和模型組灌服等容量的生理鹽水。

2.2 缺血再灌注模型 建立大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 模型［5］。制備模型的大鼠術(shù)前12 h 禁食，不禁水。大鼠采用腹腔注射麻醉，麻醉藥物選擇10%水合氯醛，劑量為350 mg／kg。顯微鏡下找到大鼠左側(cè)頸外動脈（External carotid artery，ECA），穿縫合線結(jié)扎ECA；在頸總動脈（Common carotid artery，CCA）近分叉處用動脈夾夾閉其近心端，在距分叉處約0.5 cm 血管壁上剪一小口，夾取栓線沿切口插入，送入栓線，當(dāng)栓線推進(jìn)到分叉處時(shí)，輕輕提起ECA，使栓線順利進(jìn)入頸內(nèi)動脈（Internal carotid artery，ICA），繼續(xù)輕柔推進(jìn)，當(dāng)感到有一定阻力時(shí)即停止推送，此時(shí)栓線頭端正好位于大腦中動脈（MCA） 起始部位，阻斷MCA 血流，停留90 min后，將栓線輕輕拔出恢復(fù)血流灌注。結(jié)扎頸外動脈，縫合皮膚。術(shù)中用加熱毯和白熾燈加熱，維持大鼠肛溫在 （37.5±0.3）℃，術(shù)后將大鼠置于恒溫箱中直至蘇醒。假手術(shù)組同樣進(jìn)行手術(shù)操作，不通過頸總動脈插入線栓。

2.3 神經(jīng)功能評定

2.3.1 神經(jīng)功能評分 參考文獻(xiàn)［6］。在大鼠恢復(fù)再灌注24 h 后進(jìn)行評定。包括運(yùn)動實(shí)驗(yàn)、感覺實(shí)驗(yàn)和反射測試三部分。運(yùn)動實(shí)驗(yàn)包括提尾實(shí)驗(yàn)（3 分） 和地板行走（3分）；感覺實(shí)驗(yàn)包括放置實(shí)驗(yàn)（1 分）、本體感覺實(shí)驗(yàn)（1分）、平衡木實(shí)驗(yàn)（6 分）；反射測試（4 分） 包括耳廓反射、角膜反射、驚恐反射以及癲癇，肌痙攣。最高18 分。分?jǐn)?shù)越高表明該大鼠神經(jīng)功能越好。

2.3.2 抓力實(shí)驗(yàn) 選擇合適的大鼠抓力板，建模前大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。測試過程中保持環(huán)境安靜，不要過分刺激大鼠，重復(fù)測量3 次，測大鼠抓力的平均值。

2.4 炎癥因子指標(biāo) ①血清白介素?1 （IL?1β）、腫瘤壞死因子（TNF?α），再灌注2 d 后抽取大鼠動脈血1 mL，靜置30 min 后離心分離血清，采用ELISA 法檢測IL?1β、TNF?α水平，所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒操作流程。②腦組織IL?1β、TNF?α，將各組大鼠麻醉后斷頭取出腦部組織，加入4 ℃生理鹽水（1 ∶9），勻漿后去上清液，采用放射免疫法測IL?1β、TNF?α 水平。③腦組織NF?κB 采用Western blot 法檢測，將取得的腦組織勻漿用RIPA 裂解液，取15 g總蛋白進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后加入NF?κB 抗體，于4 ℃冰箱過夜，洗膜，曝光拍照，通過Image Pro 軟件比較NF?κB與GAPDH 蛋白條帶灰度的比值表示NF?κB 蛋白相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（） 表示，多組間比較采用方差分析，以P≤0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸多糖對大鼠神經(jīng)功能的影響 如表1 所示，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和抓力低于假手術(shù)組（P＜0.05），當(dāng)歸多糖中、高劑量組神經(jīng)功能評分和抓力高于模型組（P＜0.05）。

表1 當(dāng)歸多糖對大鼠神經(jīng)功能的影響的比較（， n＝12）

表1 當(dāng)歸多糖對大鼠神經(jīng)功能的影響的比較（， n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.2 當(dāng)歸多糖對大鼠血清和腦組織IL?1β 水平的影響 如表2 所示，模型組血清和腦組織中IL?1β 水平高于假手術(shù)組（P＜0.05），同時(shí)當(dāng)歸多糖中、高劑量組IL?1β 水平低于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清和腦組織IL?1β 水平比較（pg／mL，， n＝12）

表2 各組大鼠血清和腦組織IL?1β 水平比較（pg／mL，， n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.3 當(dāng)歸多糖對大鼠血清和腦組織TNF?α 水平的影響 如表3 所示，模型組血清和腦組織中TNF?α 水平高于假手術(shù)組（P＜0.05），同時(shí)當(dāng)歸多糖中、高劑量組TNF?α水平低于模型組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清和腦組織TNF?α 水平比較（ng／mL，， n＝12）

表3 各組大鼠血清和腦組織TNF?α 水平比較（ng／mL，， n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 當(dāng)歸多糖對大鼠腦組織中NF?κB 蛋白表達(dá)的影響 如表4 所示，模型組腦組織中NF?κB 蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05），同時(shí)當(dāng)歸多糖中、高劑量組NF?κB 蛋白表達(dá)明顯低于模型組。

4 討論

腦缺血在中醫(yī)上屬于“中風(fēng)” 范疇，王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》 認(rèn)為“氣血凝滯腦氣”，陳土鐸《辨證錄》 所言“痰積則神明不清”［7］。多糖是一類天然高分子化合物，具有廣泛的生物學(xué)功能。當(dāng)歸產(chǎn)地主要分布在甘肅、陜西、湖北、云南、四川等省，其中甘肅岷縣所產(chǎn)當(dāng)歸品質(zhì)最好［8］。作為一味中藥它主要作用于血液系統(tǒng)，當(dāng)歸的主要活性物質(zhì)當(dāng)歸多糖，具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤等作用，被廣泛應(yīng)用于老年疾?。??10］。

表4 各組大鼠腦組織中NF?κB 表達(dá)的比較（， n＝12）

表4 各組大鼠腦組織中NF?κB 表達(dá)的比較（， n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制目前仍不清楚，現(xiàn)認(rèn)為與大腦內(nèi)富含氧自由基有關(guān)。缺血大腦再灌注后，產(chǎn)生過多氧自由基不能被大腦內(nèi)生性抗氧化系統(tǒng)所消除，從而對腦脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［11?12］。受損的神經(jīng)細(xì)胞會產(chǎn)生大量炎癥因子。IL?1β 屬于白細(xì)胞介素?1 （IL?1），是一種重要的促炎癥介質(zhì)并在細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［13］。TNF?α 是由活化的單核巨噬細(xì)胞釋放的促炎因子，能提高中性粒細(xì)胞的吞噬功能，具有抗感染、促進(jìn)炎細(xì)胞分化的作用，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞膜上信號通路傳導(dǎo)異常，當(dāng)與白介素協(xié)同時(shí)，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激作用增強(qiáng)［14?15］。IL?1β 能夠激發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)NF?κB 信號通路［16］。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和抓力明顯低于假手術(shù)組，當(dāng)歸多糖中、高劑量組神經(jīng)功能評分和抓力明顯高于模型組。說明當(dāng)歸多糖中、高劑量能改善缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能。考慮可能與當(dāng)歸多糖清除腦部過量炎癥因子有關(guān)，從而減少炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組血清和腦組織中IL?1β、TNF?α 水平明顯高于假手術(shù)組，同時(shí)當(dāng)歸多糖中、高劑量組IL?1β、TNF?α 水平明顯低于模型組。模型組腦組織中NF?κB蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，同時(shí)當(dāng)歸多糖中、高劑量組NF?κB 蛋白表達(dá)明顯低于模型組。說明隨著當(dāng)歸多糖劑量的增加，可以有效降低大鼠血清和腦組織中炎癥因子水平，尤其是高劑量當(dāng)歸多糖（60 mg／kg） 效果較好。高劑量當(dāng)歸多糖可能通過降低血清中IL?1 和TNF?α 水平，并進(jìn)一步阻斷神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NF?κB 信號通路，減少大量的氧自由基通過細(xì)胞膜上的信號通路進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，損傷腦組織［17］。

綜上所述，預(yù)給藥當(dāng)歸多糖（60 mg／kg） 可以減輕缺血再灌注大鼠腦組織中的炎癥反應(yīng)，有助于大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。