鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素產(chǎn)地分布規(guī)律

顧志榮 薛春苗* 曹俊嶺 葛 斌 楊文華潘 霖

（1.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科， 甘肅蘭州730000； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥學(xué)部， 北京100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部， 北京100078）

鎖陽(yáng)來(lái)源于鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖，多寄生于蒺藜科白刺屬植物根部，資源主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、青海等西北地區(qū)的沙漠及半沙漠地帶［1］。鎖陽(yáng)是常用中藥、蒙藥及功能保健食品原料，其防治疾病與保健功能均受到人們的廣泛關(guān)注與青睞。鎖陽(yáng)含有黃酮、多酚、三萜、多糖等成分，具有調(diào)節(jié)性激素水平［2］、增強(qiáng)生殖功能［3］、保護(hù)神經(jīng)損傷［4］、抗氧化［5］、抗骨質(zhì)疏松［6］、抗前列腺增生［7］、增強(qiáng)免疫［8］等多種藥理作用。

鎖陽(yáng)富含有Zn、Fe、Ca、Mn、K、Se 等對(duì)人體健康、生長(zhǎng)發(fā)育和疾病防治有益的元素，同時(shí)也含有Pb、Cd、Cr、As、Hg 等對(duì)人體有害的重金屬元素［9］。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，鎖陽(yáng)作為沙生藥用植物，其無(wú)機(jī)元素／重金屬富集規(guī)律及其與產(chǎn)地環(huán)境的關(guān)聯(lián)性研究尚未開展，無(wú)機(jī)元素的產(chǎn)地分布規(guī)律、綜合質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)、健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等相關(guān)報(bào)道較少，僅有10 余年前的無(wú)機(jī)元素含有量測(cè)定研究［9?10］，但因生長(zhǎng)環(huán)境及氣候條件變化等原因，其參考價(jià)值有限。鑒于此，本研究基于多產(chǎn)地、大樣本分析鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素的產(chǎn)地分布規(guī)律，建立其元素指紋圖譜，確定特征性無(wú)機(jī)元素，以期為鎖陽(yáng)的安全用藥及綜合質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 藥材 65 批鎖陽(yáng)藥材，采集于甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏等5 個(gè)省 （區(qū)），包括酒泉、敦煌、武威、張掖、阿拉善左旗、阿拉善右旗、石嘴山、和田、喀什、阿勒泰、海南、海西等12 個(gè)市／區(qū)／州／旗，所有樣品均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器與試劑 iCAP RQ 型ICP?MS 儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；ETHOS 900 微波消解系統(tǒng)（意大利邁爾斯通公司）；Milli?Q 超純水裝置（法國(guó)密理博公司）；BT 125D 電子天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）。

鈉（Na）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、鋅（Zn）、錳（Mn）、鈷（Co）、鍶（Sr）、鎳（Ni）、銀 （Ag）、鋇 （Ba）、鈦 （Ti）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu） 等單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度均為1 000 μg／mL，購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；鍺 （Ge）、銦 （In）、鉍 （Bi）、鈧（Sc） 等單元素內(nèi)標(biāo)液，質(zhì)量濃度均為10 μg／mL，購(gòu)于美國(guó)SPEX Certiprep 公司。柑橘葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)GSB?11），購(gòu)于中國(guó)地球物理化學(xué)勘察研究所。HNO3和H2O2均為優(yōu)級(jí)純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 內(nèi)標(biāo)液 精密移取Ge、In、Bi、Sc 各單元素內(nèi)標(biāo)液適量，置于100 mL 量瓶中，以去離子水稀釋成1 μg／mL 的混合內(nèi)標(biāo)液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密量取各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%HNO3溶液，將Na、K、Ca、Mg、Fe元素制備成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg／L 的系列混合對(duì)照品溶液；將Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ba、Ti、Pb、Cu 元素制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg／L 的系列混合對(duì)照品溶液；將As、Ag、Cr、Cd、Hg 元素制備成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg／L 的系列混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 取本品粉末（已過(guò)80 目篩）約0.5 g，精密稱定后置于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入8 mL HNO3和2 mL H2O2，搖勻，靜置至氣泡散盡，置微波消解系統(tǒng)內(nèi)消解。微波功率為1 000 W，在20 min 內(nèi)溫度由室溫升至200 ℃，200 ℃維持20 min，待消解完全后冷卻至室溫。取出消解罐，在通風(fēng)櫥中將酸揮盡，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，以去離子水洗滌消解罐與蓋子各3次，洗液合并于量瓶中，以去離子水稀釋至刻度即得。同時(shí)、同法制備空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)參照物溶液。

2.2 ICP?MS 條件 等離子體射頻功率1 300 W；霧化氣體積流量（氬氣） 1.1 L／min；輔助氣體積流量1.0 L／min；等離子流體積流量15 L／min；霧化室為石英雙通道，霧化室溫度2 ℃；采樣錐孔徑1.1 mm；截取錐孔徑0.4 mm；采樣深度7.0 mm；脈沖電壓為1 050 V；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)數(shù)為40 r／min；炬管為石英一體化，2.5 mm 中心通道；駐留時(shí)間30 s；動(dòng)能歧視（KED） 電壓3 V。重復(fù)測(cè)定3 次取平均值。

2.3 樣品含有量測(cè)定 相對(duì)分子質(zhì)量小于100 的元素 Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Sr、Ni、Ti、As 采用Ge 作為內(nèi)標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量大于100 的元素Ag、Ba、Pb、Hg、Cd 采用In作為內(nèi)標(biāo)。對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管需一直置于內(nèi)標(biāo)溶液中，同時(shí)樣品管需插入質(zhì)量濃度由低到高的對(duì)照品溶液中，依次進(jìn)行測(cè)定。

由于鎖陽(yáng)中各元素的含有量差異懸殊，故測(cè)定Na、K 時(shí)稀釋至1／1 000 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr 時(shí)稀釋至1／100 進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定Cu、Ti 時(shí)稀釋至1／10 進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法求取樣品中各元素含有量。

2.4 不同產(chǎn)地鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素含有量比較 將測(cè)定結(jié)果按市級(jí)產(chǎn)地表示為（） 的形式，采用方差分析（ANOVA） 進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見表2。可知，不同產(chǎn)地鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素含有量在一定程度上顯示了產(chǎn)地間差異性，并且含有量分布沒有明顯的地域性聚集特征，其中尤以Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co、Ti、Cd、Hg 等9 種元素在不同產(chǎn)地間的含有量變異較大。

表2 不同產(chǎn)區(qū)樣品無(wú)機(jī)元素含有量比較（，μg／g）Tab.2 Comparison of inorganic element contents in samples from different origins （，μg／g）

表2 不同產(chǎn)區(qū)樣品無(wú)機(jī)元素含有量比較（，μg／g）Tab.2 Comparison of inorganic element contents in samples from different origins （，μg／g）

續(xù)表2

2.5 元素指紋圖譜建立及相似度分析 為直觀比較鎖陽(yáng)中19 種元素含有量的分布趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)將所有元素?cái)U(kuò)大或縮小至同一數(shù)量級(jí)，其中Na、K縮小1 000 倍，Ca、Mg、Fe 縮小100 倍，Zn、Mn縮小10 倍，Ag、Cr、Cd、As 擴(kuò)大10 倍，Hg 擴(kuò)大100 倍，其余元素不作改變。將各元素按原子序數(shù)由小到大排列，以元素種類為橫坐標(biāo)、調(diào)整后的相對(duì)含有量為縱坐標(biāo)繪制含有量的分布曲線［11］，得到鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素指紋圖譜，見圖1。可以直觀看出，鎖陽(yáng)元素指紋圖譜的峰型與走勢(shì)基本一致，但清楚可見部分樣品的峰型存在特異性且相對(duì)含有量差異明顯。

分別以平均數(shù)法和中位數(shù)法求取對(duì)照?qǐng)D譜，再分別采用“夾角余弦法”［12］“相關(guān)系數(shù)法”［13］計(jì)算指紋圖譜相似度，見表3。65 批鎖陽(yáng)中，有49批的夾角余弦值＞0.9，26 批的夾角余弦值＜0.9，39 批的相關(guān)系數(shù)＞0.8，36 批的相關(guān)系數(shù)＜0.8。表明，部分產(chǎn)地鎖陽(yáng)樣品的峰型特異性明顯，相對(duì)含有量差異較大。

圖1 鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素指紋圖譜Fig.1 Inorganic elemental fingerprints of C.songaricum

2.6 無(wú)機(jī)元素主成分分析 以鎖陽(yáng)中19 種無(wú)機(jī)元素含有量為變量進(jìn)行主成分分析，主成分分析前先對(duì)元素含有量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果共提取了5 個(gè)主成分（PC1～PC5），主成分分析特征值及貢獻(xiàn)率見表4，投影圖見圖2。主成分分析累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.533%，能夠反映整體變量的主要特征。由主成分分析投影圖可知，主成分分析可基于鎖陽(yáng)中19 種無(wú)機(jī)元素含有量，對(duì)鎖陽(yáng)樣品進(jìn)行省級(jí)產(chǎn)地的分類鑒別，從而確定鎖陽(yáng)的省級(jí)產(chǎn)地分布輪廓。其中，Ⅰ類是甘肅產(chǎn)鎖陽(yáng)，Ⅱ類是青海產(chǎn)鎖陽(yáng)，Ⅲ類是內(nèi)蒙古產(chǎn)鎖陽(yáng)，Ⅳ類是新疆產(chǎn)鎖陽(yáng)；第1 象限主要為甘肅張掖、武威產(chǎn)鎖陽(yáng)，第2 象限主要為甘肅酒泉、敦煌產(chǎn)鎖陽(yáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地鎖陽(yáng)的區(qū)分界線不甚明確，離群樣本較多；并且，主成分分析未能對(duì)寧夏產(chǎn)鎖陽(yáng)進(jìn)行識(shí)別，也無(wú)法完全確定鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素的市級(jí)產(chǎn)地分布輪廓。

表3 65 批樣品相似度Tab.3 Similarities of sixty?five batches of samples

表4 主成分特征值及貢獻(xiàn)率Tab.4 Eigenvalues and contribution rates of principal components

圖2 樣品主成分分析投影圖Fig.2 Scatter plot of samples by principal component analysis

2.7 基于載荷分析的特征性元素分析 采用載荷分析通過(guò)“降維” 原理識(shí)別鎖陽(yáng)的特征性無(wú)機(jī)元素［14］，見圖3。載荷圖表示各元素對(duì)主成分綜合作用的貢獻(xiàn)，每個(gè)點(diǎn)代表一種元素，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)表示權(quán)重越大，即該元素對(duì)整體質(zhì)量的貢獻(xiàn)越大。圖中紅色的點(diǎn)所代表的元素，其變量重要性投影值（VIP） 大于1，表明該元素對(duì)整體質(zhì)量的貢獻(xiàn)度高于平均水平?？芍?，載荷圖中VIP 值大于1 的元素為Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co，這些元素是影響鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素整體組成的波動(dòng)性元素，因此是鎖陽(yáng)的特征性無(wú)機(jī)元素，可作為其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的參考之一。

圖3 無(wú)機(jī)元素主成分載荷圖Fig.3 Loading plot of inorganic elements

2.8 無(wú)機(jī)元素間相關(guān)性分析 結(jié)果見表5。顯示鎖陽(yáng)中的元素Ca?Cu、Fe?Ag、Co?Ba、Na?Mn 均呈正相關(guān) （P＜0.05），Mg?Zn、Mn?Cd、Pb?Cr、K?Ba、K?Cr 均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在鎖陽(yáng)對(duì)無(wú)機(jī)元素的吸收累積過(guò)程中，呈正相關(guān)的元素間存在著協(xié)同促進(jìn)的作用，而呈負(fù)相關(guān)的元素則存在著相互拮抗作用［15］。

3 討論

2015 年版《中國(guó)藥典》 對(duì)中藥材中重金屬元素的限度規(guī)定為，Pb≤5.0 μg／g，Cd≤0.3 μg／g，Cr≤2.0 μg／g，As ≤2.0 μg／g，Hg ≤0.2 μg／g，Cu≤20.0 μg／g［16］；我國(guó)外貿(mào)部制定的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》 （WM2?2001） 中規(guī)定與之相同，但未對(duì)Cr 作出規(guī)定，同時(shí)規(guī)定了重金屬總量≤20.0 μg／g［17］。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比可知，甘肅酒泉、新疆喀什、青海海南等3 個(gè)產(chǎn)地鎖陽(yáng)中Cd 元素超標(biāo)，分別為（0.330±0.108）、（0.387±0.307）、（0.399±0.146） μg／g；其余各產(chǎn)地樣品中各種重金屬元素及重金屬總量均符合相關(guān)規(guī)定。

表5 樣品中無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性分析Tab.5 Correlation analysis of inorganic elements in various samples

當(dāng)前，有機(jī)成分是中藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)普遍采用的指標(biāo)，而無(wú)機(jī)元素主要從安全性角度對(duì)Pb、Cd、As、Hg、Cu 等有害重金屬進(jìn)行控制［18］，而對(duì)其他無(wú)機(jī)元素并未足夠重視。方差分析證實(shí)，Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co、Ti、Cd、Hg 元素含有量在不同產(chǎn)地間的變異較大，而載荷分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ca、Mn、Ni、Zn、Co、Cu 元素是鎖陽(yáng)的特征性無(wú)機(jī)元素。Ca 參與人體神經(jīng)、骨骼、肌肉代謝，并維持正常神經(jīng)肌肉興奮性，被譽(yù)為“人體生命之本”。超氧化物岐化酶（SOD） 是人體抗氧化損傷的重要保護(hù)酶，Zn、Mn、Cu 對(duì)SOD 的活性及穩(wěn)定性具有重要作用［19］。另一方面，目前研究認(rèn)為Zn／Cu 比值與補(bǔ)腎中藥的補(bǔ)腎助陽(yáng)作用密切相關(guān)［20］。Ni 與Co 均有促進(jìn)造血功能的作用，貧血病人血Ni、Co 含有量減少，同時(shí)Fe 吸收減少，而補(bǔ)充Ni、Co 后紅細(xì)胞、血紅素及白細(xì)胞均增加，并且Co 能通過(guò)組成維生素B12 來(lái)參與機(jī)體生理活動(dòng)［21］?？梢姡狙芯克Y選的Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Co 等鎖陽(yáng)的特征性元素，與其補(bǔ)腎助陽(yáng)、抗氧化、抗衰老、提高免疫等生物作用密切相關(guān)，具有明確的科學(xué)依據(jù)及指向性。

相似度分析表明，部分產(chǎn)地鎖陽(yáng)樣品的峰型特異性明顯，相對(duì)含有量差異較大，但這些樣品的產(chǎn)地分布沒有明顯的地域性聚集特征，而主成分分析可以進(jìn)一步對(duì)鎖陽(yáng)樣品進(jìn)行省級(jí)產(chǎn)地的分類鑒別，從而確定鎖陽(yáng)的省級(jí)產(chǎn)地分布輪廓［22］。而另一方面，主成分分析無(wú)法完全確定鎖陽(yáng)無(wú)機(jī)元素的市級(jí)產(chǎn)地分布輪廓，其原因可能與鎖陽(yáng)的產(chǎn)地分布范圍廣闊，東西跨度大，環(huán)境因素差異大有關(guān)。

此外，鎖陽(yáng)中的元素Ca?Cu、Fe?Ag 呈顯著正相關(guān)，提示人們?cè)讷@取Ca、Cu、Fe、Ag 等元素作為正常補(bǔ)充和調(diào)節(jié)機(jī)體的同時(shí)，應(yīng)注意Cu、Ag 的過(guò)度獲取對(duì)機(jī)體造成傷害。