北葶藶子炮制前后對H2 O2 誘導的H9c2 心肌細胞損傷保護作用

王慧慧 張 莉 楊方方 馮衛(wèi)生 鄭曉珂

（河南中醫(yī)藥大學， 河南鄭州450046）

北葶藶子，又稱苦葶藶子，十字花科獨行菜屬植物獨行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子，主產(chǎn)于河北、遼寧、內(nèi)蒙古等地區(qū)［1］。北葶藶子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為一味傳統(tǒng)中藥，其在中醫(yī)臨床中常用于瀉肺平喘、利水消腫?，F(xiàn)代研究已證明北葶藶子具有強心、調(diào)血脂、利尿、止咳等功效［2］。已有文獻報道，葶藶子可顯著增強犬的心肌收縮力，增強正性肌力作用，增加心臟輸出量，減輕心臟負荷，可作為臨床治療心衰的有效藥物［3?6］。本實驗室前期研究［7］也證實了葶藶子能夠有效改善阿霉素誘導的慢性心衰大鼠的心臟功能。由于在臨床心血管疾病治療中，葶藶子生品與炮制品均有大量使用，本課題組在后續(xù)研究中，將北葶藶子生品與炮制品的化學成分進行對比，發(fā)現(xiàn)北葶藶子清炒炮制后多種化學成分發(fā)生了改變，脂肪油含有量降低［8］。經(jīng)過進一步研究，發(fā)現(xiàn)北葶藶子經(jīng)過炮制后，對心肌細胞保護作用增強。本研究探討北葶藶子炮制品與生品水提取物對H2O2誘導H9c2 心肌細胞損傷的影響。

1 材料

1.1 細胞株 H9c2 大鼠心肌細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 北葶藶子采自河南南陽，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授和董誠明教授鑒定為十字花科植物獨行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子。DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號1833721）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所，批號17030506）；H2O2溶液（天津恒興化學試劑制造有限公司，批號20170410）；普羅布考（美國Sigma 公司，貨號P9672）；AnnexinV?FITC／PI 凋亡檢測試劑盒 （美國 BD 公司，貨號6119909）；JC?1 線粒體膜電位試劑盒（美國BD 公司，貨號6113545）；活性氧檢測ROS 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20170511）；MDC 自噬檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20170530）；乳酸脫羥酶（LDH） 試劑盒、超氧化物歧化酶（T?SOD） 檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?PX） 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170314、20170308、201710309、20170306 ）；caspase?3 （美國Cell Signaling 公司，貨號9665 s）；Bax、Bcl?2、β?actin 抗體（英國Abcam 公司，貨號分別為ab32503、ab59348、ab56830）；羊抗兔二抗（美國Li?Cor 公司，批號C80911?11）、羊抗鼠二抗（美國國Li?Cor 公司，批號C80816?10）。

1.3 儀器 ELIEⅡ細胞培養(yǎng)箱（美國Revco 公司）；ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Mill?Q 純水儀（賽恩斯科技有限公司）；SW?CJ?1F 型凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；TDZ5?WS 型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；精密分析天平 （瑞士Mettmer Toledo 公司）；iMark 酶標儀（美國Bio?Rad 公司）；BioMate 3S 分光光度計 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；FACS AriaⅢ流式細胞儀、Aria 電腦工作站（美國BD 公司）；Odyssey CLx 雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國Li?Cor 公司）。

2 方法

2.1 藥物炮制與提取 北葶藶子生品水提物和炮制品水提物制備方法參照本課題組已建立的方法［9?10］，北葶藶子生品水提物提取回收率為6.6%，炮制品水提物提取回收率為13.4%。

2.2 細胞培養(yǎng)與分組 H9c2 大鼠心肌細胞置于37 ℃、5%CO2，飽和濕度，無菌環(huán)境下，使用含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每2～3天更換1 次培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細胞用于本實驗。96 孔板實驗中，細胞濃度以5 × 104／mL，200 μL／ 孔種板；6 孔板實驗中，細胞濃度以5×105／mL，3 mL／孔種板。細胞培養(yǎng)24 h 后，正常組給予新鮮含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，模型組給予200 μmol／L H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，普羅布考組給予200 μmol／L H2O2和10 μg／mL 普羅布考的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，不同劑量北葶藶子生品組（以干浸膏劑量算） 分別給予400、200、100 μg／mL 北葶藶子生品和200 μmol／L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，不同劑量北葶藶子炮制品（以干浸膏劑量算） 分別給予400、200、100 μg／mL 北葶藶子炮制品和200 μmol／L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h。

2.3 MTT 法檢測細胞存活率 將H9c2 細胞接種于96 孔板中，經(jīng)藥物處理結(jié)束后，吸除培養(yǎng)液上清，換用含10%MTT 的新鮮培養(yǎng)液孵育4 h，棄除培養(yǎng)液上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min 混勻，用酶標儀檢測波長490 nm 處吸光度值（OD）。每組設置6 個復孔，實驗重復3 次。細胞存活率＝［（OD實驗組／OD正常組）］ × 100%。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞ROS、線粒體膜電位、細胞凋亡率、自噬空泡 將H9c2 細胞接種于6 孔板，經(jīng)藥物處理結(jié)束后，吸取培養(yǎng)上清液，洗滌1次并吸取洗滌液，每孔加入0.25% 胰蛋白酶200 μL 進行消化細胞，用3 mL 含血清的培養(yǎng)液終止消化，將細胞懸液與上述收集液以800 r／min 離心5 min，收取細胞，按照試劑盒提供的說明書進行AnnexinV?FITC／PI 雙染、DCFH?DA 探針孵育、JC?1 探針孵育及MDC 染料孵育及其他規(guī)定操作，利用流式細胞儀和Aria 電腦工作站進行各項檢測分析。實驗重復3 次。

2.5 Incell?Western 法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白 將H9c2 細胞接種于96 孔板，經(jīng)藥物處理結(jié)束后，小心吸出培養(yǎng)液。在室溫條件下，將細胞用150 μL 10%甲醛固定20 min，用150 μL 0.1%Triton?x?100洗滌細胞（5 min／次，5 次），用150 μL 封閉液封閉1.5 h；在4 ℃條件下進行Bax、Bcl?2、caspase?3、β?actin 一抗孵育 （1 ∶100 稀釋，50 μL／孔，12 h），然后，在室溫條件下，PBST 洗滌細胞（5 min／次，5 次）；在室溫和避光條件下孵育二抗（1 ∶500 稀釋，50 μL／孔，1 h），PBST 洗滌細胞（5 min／次，5 次）；小心除盡洗滌液，使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLx，USA） 進行雙通道700、800 nm 檢測與分析。實驗重復3 次。

2.6 細胞LDH、MDA、T?SOD、GSH?PX 水平檢測 將H9c2 細胞接種于6 孔板，經(jīng)藥物處理結(jié)束后，收集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進行細胞培養(yǎng)上清液中LDH 水平的檢測；收集細胞，進行反復凍融3 次，測定樣品蛋白濃度，遵照試劑盒說明書進行細胞中MDA、T?SOD、GSH?PX 水平檢測。實驗重復3 次。

2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞存活率的影響 與正常組比較，模型組H9c2 細胞存活率降低（P＜0.01）；100、200、400 μg／mL 北葶藶子炮制品和生品水提物干預后，H2O2誘導的H9c2 細胞存活率均提高（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。最終選定200 μg／mL 北葶藶子生品、炮制品進行后續(xù)作用機制研究。

3.2 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞凋亡的影響 與正常組比較，模型組H9c2 心肌細胞凋亡率和壞死率增加（P＜0.01），存活率下降（P＜0.01）。與模型組比較，200 μg／mL 北葶藶子生品、炮制品均能降低H9c2 細胞的凋亡率及壞死率（P＜0.01），提高H9c2 細胞的存活率（P＜0.01），且北葶藶子炮制品組與生品組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖1 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞存活的影響（， n＝5）Fig.1 Effects of the crude and processed LaSs on HHCs survival （， n＝5）

3.3 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞自噬空泡的影響 與正常組比較，模型組H9c2 心肌細胞的自噬空泡增多（P＜0.01），與模型組比較，給予200 μg／mL 北葶藶子生品、炮制品均能減少H9c2 細胞的自噬空泡（P＜0.01）。見圖3。

3.4 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞ROS 水平的影響 與正常組比較，模型組H9c2 心肌細胞的細胞ROS 水平上升（P＜0.01）；與模型組比較，給予200 μg／mL 北葶藶子生品、炮制品后均能降低H9c2 細胞ROS 水平（P＜0.01）。見圖4。

3.5 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞線粒體膜電位的影響 與正常組比較，模型組H9c2 心肌細胞的線粒體膜電位下降（P＜0.01），與模型組比較，給予200 μg／mL 北葶藶子生品、炮制品后均能升高H9c2 細胞的線粒體膜電位（P＜0.01），且北葶藶子炮制品組與北葶藶子生品組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5。

3.6 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞caspase?3、Bax、Bcl?2 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組caspase?3 表達、Bax／Bcl?2 比值升高（P＜0.01）。與模型組比較，北葶藶子生品、炮制品均降低細胞Bax／Bcl?2 比值（P＜0.01），且北葶藶子炮制品組caspase?3 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖6。

圖2 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞凋亡的影響（， n＝3）Fig.2 Effects of the crude and processed LaSs on HHCs apoptosis （， n＝3）

圖3 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞自噬空泡的影響（， n＝3）Fig.3 Effects of the crude and processed LaSs on HHCs autophagic vacuoles （， n＝3）

圖4 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞ROS 水平的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of the crude and processed LaSs on HHCs ROS level （， n＝3）

圖5 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞線粒體膜電位的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of the crude and processed LaSs on the mitochondrial membrane potential of HHCs （， n＝3）

3.7 北葶藶子炮制前后對H2O2誘導的H9c2 細胞LDH、T?SOD、MDA、GSH?PX 水平的影響 與正常組比較，模型組H9c2 細胞培養(yǎng)液中LDH 水平及細胞MDA 水平升高，H9c2 細胞T?SOD、GSH?Px水平下降（P＜0.01）。與模型組比較，北葶藶子生品組 （200 μg／mL） 和北葶藶子炮制品組（200 μg／mL）T?SOD、GSH?PX 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），細胞培養(yǎng)液中LDH 水平和細胞MDA 水平降低（P＜0.01）。見表1。

4 討論

圖6 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2細胞caspase?3、Bax、Bcl?2 蛋白表達的影響（， n＝3）Fig.6 Effects of the crude and processed LaSs on caspase?3，Bax，Bcl?2 protein expression of HHCs （， n＝3）

葶藶子最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》 中以生品入藥，后經(jīng)《金匱玉函經(jīng)》 開創(chuàng)了葶藶子炒法炮制品入藥的先例［11］。在中國方劑數(shù)據(jù)庫中檢索葶藶子方劑后發(fā)現(xiàn)，葶藶子生品與炮制品在臨床心血管疾病治療中均有大量的使用。本實驗結(jié)果表明，200 μmol／L H2O2可引起H9c2 細胞明顯的心肌細胞氧化損傷，包括引發(fā)心肌細胞存活降低，線粒體膜電位下降以及細胞凋亡和自噬通路激活。經(jīng)過北葶藶子生品炮制品處理后，發(fā)現(xiàn)在 100～400 μg／mL劑量時，北葶藶子生品與炮制品均能有效改善由H2O2誘導的H9c2 細胞損傷，且同等劑量條件下炮制品對H9c2 細胞活力的提升作用，以及對細胞培養(yǎng)液中細胞毒性標志物LDH 水平的抑制作用均較生品作用好，故判斷北葶藶子炮制品對心肌細胞的保護作用優(yōu)于生品。然后，進一步從氧化應激，凋亡和自噬方面進行了北葶藶子抗H2O2誘導H9c2 心肌細胞損傷機制研究，并對北葶藶子炮制前后進行對比。

細胞凋亡在心力衰竭中產(chǎn)生的重要作用不容忽視，將是研究心力衰竭的重點方向之一［12］，凋亡信號能引起促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl?2 表達比例失調(diào)，致使線粒體膜電位下降，細胞色素c釋放，造成caspase?3 級聯(lián)通路激活，最終導致細胞凋亡。本研究表明，200 μg／mL 北葶藶子生品或炮制處理后，兩者均可一定程度的降低H2O2誘導的H9c2 細胞凋亡率，提升細胞線粒體膜電位。同時發(fā)現(xiàn)，北葶藶子生品和炮制品均可調(diào)節(jié)Bax／Bcl?2比值。推測北葶藶子通過對凋亡通路的調(diào)控，進而保護心肌細胞。此外，大量研究表明，細胞還可以通過自噬調(diào)節(jié)自身死亡，正常水平的自噬保證細胞的持續(xù)生存，過度的自噬將造成細胞的程序性死亡［13］。本研究結(jié)果表明，北葶藶子炮制前后均可一定程度的降低H9c2 細胞自噬水平。經(jīng)過對比分析發(fā)現(xiàn)，北葶藶子炮制前和炮制后對凋亡和自噬的影響幾乎無差別，但北葶藶子炮制后對caspase?3蛋白調(diào)節(jié)作用比炮制前作用強。

表1 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞LDH、T?SOD、MDA、GSH?PX 水平的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of the crude and processed LaSs on the LDH，T?SOD，MDA and GSH?PX levels of HHCs （， n＝3）

表1 北葶藶子生品與炮制品對H2O2 誘導的H9c2 細胞LDH、T?SOD、MDA、GSH?PX 水平的影響（， n＝3）Tab.1 Effects of the crude and processed LaSs on the LDH，T?SOD，MDA and GSH?PX levels of HHCs （， n＝3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

有報道指出，H2O2可通過刺激細胞產(chǎn)生ROS自由基誘發(fā)凋亡，ROS 自由基過多已經(jīng)成為缺血性心臟病的主要特征［14?15］。研究發(fā)現(xiàn)，ROS 產(chǎn)生過多會進一步造成線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，引起線粒體膜電位去極化，激活凋亡執(zhí)行通路caspase?3 級聯(lián)通路，細胞凋亡［16］。還有報道指出，大量的活性氧能誘導產(chǎn)生細胞自噬從而造成細胞死亡［17］。本研究結(jié)果表明，北葶藶子生品或炮制品可提高細胞抗氧化酶T?SOD、GSH?PX 水平，降低細胞氧化損傷產(chǎn)物MDA 水平，調(diào)節(jié)細胞總ROS 水平，從而降低細胞毒性標志物LDH 在細胞上清中的水平，且炮制品整體效果更好，這與MTT 法測定細胞活力的結(jié)果一致。而且，北葶藶子炮制品對細胞氧化損傷產(chǎn)物MDA 水平的作用顯著性優(yōu)于生品（P＜0.05），故推測通過炮制，北葶藶子改善細胞氧化應激能力得到增強。

中藥炮制是寶貴的中國醫(yī)藥遺產(chǎn)，其主要目的是增效、減毒、易于貯藏及便于服用等。數(shù)千年來保證了中醫(yī)臨床用藥安全有效［18］。中藥行里流傳的“逢子必炒” “逢子必搗” 之說，說的正是果實和種子類藥物經(jīng)炒后，外皮爆裂，質(zhì)地酥脆，易于煎出有效成分［19］。葶藶子的古代炮制方法較多，但自漢代的《金匱玉函經(jīng)》 中記載葶藶子熬（炒）法炮制以來，炒法就成了主流并沿用至今，且其也是《中國藥典》 的法定炮制方法。本研究根據(jù)藥典中葶藶子的炮制方法進行清炒炮制［20］。據(jù)文獻報道，北葶藶子中所含的活性成分包括強心苷類、異硫氰酸和硫苷類、脂肪油類、生物堿類、黃酮類、類萜類等［21］。有研究指出，葶藶子炒用的原理一是外殼破裂而易于煎出藥效，二是由于酶受破壞，而有利于苷類成分的保存［22］。還有文獻報道指出，北葶藶子經(jīng)過清炒炮制后芥子苷的含有量升高［23］。北葶藶子中的脂肪油比重高達35%［24?25］，本課題組通過GC?MS 分析，證明北葶藶子經(jīng)過清炒炮制后多種脂肪油含有量發(fā)生降低［8］。經(jīng)過本研究發(fā)現(xiàn)，通過炮制北葶藶子改善細胞氧化應激的能力得到增強，從而對心肌細胞保護作用增強，因此推測北葶藶子炮制品提取物中抗氧化成分含有量有所增高。

綜上所述，北葶藶子炮制前后均可以有效改善H2O2誘導的H9c2 心肌細胞損傷，提高心肌細胞活力，抑制細胞凋亡和自噬，改善心肌細胞內(nèi)氧化應激。北葶藶子炮制品比生品對心肌細胞存活率的提高作用更強，這與其炮制后抗氧化成分溶出率增多是否有關(guān)尚需進一步研究。