HPLC 法同時(shí)測(cè)定紫白栓中9 種成分

吳學(xué)輝 肖 欽 肖 淋 程心玲 潘艷琳

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部， 福建福州350004）

紫白栓為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院制劑紫白膏（閩藥制字Z06106031） 改進(jìn)而來(lái)，由紫草、大黃、白及、煅石膏、冰片5 味藥材組成，主要用于內(nèi)外痔、肛裂、肛周炎之血熱證等病癥的治療，可有效防治混合痔術(shù)后便時(shí)出血［1?2］，更快減輕肛緣水腫和疼痛癥狀［3?5］；通過(guò)刺激血管內(nèi)皮增長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)血管新生，改善局部組織的缺血狀態(tài)，促進(jìn)手術(shù)創(chuàng)面的愈合［6?8］；有效緩解濕熱下注型肛裂術(shù)后肛門局部疼痛［9］，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有藥味TLC 定性鑒別及栓劑通則項(xiàng)檢查。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定紫白栓中紫草所含乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素，大黃所含蘆薈大黃素、大黃素甲醚，白及所含貝母蘭寧、山藥素Ⅲ的含有量，以期為提高其質(zhì)量分析水平、完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；MS103DU 型電子分析天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）。β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧（批號(hào)111689?201805，CAS 號(hào)34539?65?6，純度98.0%）、蘆薈大黃素（批號(hào)110795?201710，CAS 號(hào)481?72?1，純度 98.3%）、大黃素甲醚 （批號(hào) 110758?201817，CAS號(hào)521?61?9，純度99.2%） 對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；貝母蘭寧（批號(hào)CFS201801，CAS 號(hào)82344?82?9，純度98.0%）、山藥素Ⅲ（批號(hào)CFS201802，CAS 號(hào)56684?87?8，純度98.0%） 對(duì)照品均購(gòu)于武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙酰紫草素 （批號(hào)16030121，CAS 號(hào)24502?78?1，純度99.7%）、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧（批號(hào)14071422，CAS 號(hào)69091?17?4，純度99.9%）、異戊酰紫草素（批號(hào)18040322，CAS 號(hào)76549?35?4，純度98.0%） 對(duì)照品均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；異丁酰紫草素（批號(hào)Y?189?170410，CAS 號(hào)52438?12?7，純度98.0%） 對(duì)照品購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司。紫白栓（每粒重1.7 g，批號(hào)190805、190812、190827）來(lái)源于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，70%甲醇制成含貝母蘭寧0.152 mg／mL、山藥素Ⅲ0.318 mg／mL、乙酰紫草素0.796 mg／mL、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧0.374 mg／mL、異丁酰紫草素0.292 mg／mL、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧0.434 mg／mL、異戊酰紫草素0.932 mg／mL、蘆薈大黃素0.258 mg／mL、大黃素甲醚0.112 mg／mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，70% 甲醇稀釋，即得 （各成分質(zhì)量濃度分別為7.6、15.9、39.8、18.7、14.6、21.7、46.6、12.9、5.6 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 取栓劑適量，剪碎，混勻，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇［10?11］，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，取出，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按栓劑處方工藝，分別制備缺白及、缺紫草、缺大黃的陰性樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈 （A） ?0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～11.0 min，40.0%A；11.0～20.0 min，40.0%～55.0% A；20.0～48.0 min，55.0%～76.0% A；48.0～62.0 min，76.0%～85.0% A；62.0～70.0 min，85.0%～40.0%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm （0～48.0 min，貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素［12?17］）、254 nm （48.0～70.0 min，蘆薈大黃素、大黃素甲醚［12，18］）；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，色譜圖基線平穩(wěn)，各成分與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到有效分離（分離度均＞1.5），理論塔板數(shù)均不低于4 500，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于20 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為1.15%、0.97%、0.83%、1.02%、1.21%、0.58%、0.43%、1.19%、0.92%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

2.5.2 日間精密度 精密吸取“2.3” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定3 d，測(cè)得貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為1.46%、1.15%、0.98%、1.24%、1.59%、0.71%、0.55%、1.47%、1.06%，表明該方法日間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批栓劑（批號(hào)190805）適量，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚含有量RSD 分別為1.83%、0.65%、1.43%、1.62%、0.68%、0.55%、1.09%、1.74%、0.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD 分別為1.23%、0.91%、0.75%、0.83%、1.05%、0.68%、0.59%、1.13%、1.29%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的同一批栓劑（批號(hào)190805） 適量，剪碎，混勻，精密稱取9 份，每份1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入含貝母蘭寧0.084 mg／mL、山藥素Ⅲ0.216 mg／mL、乙酰紫草素0.482 mg／mL、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧0.246 mg／mL、異丁酰紫草素0.198 mg／mL、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧0.284 mg／mL、異戊酰紫草素0.652 mg／mL、蘆薈大黃素0.176 mg／mL、大黃素甲醚0.062 mg／mL 的對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，使各成分對(duì)照品加入量分別約為樣品原有量的50%、100%、150%，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚平均加樣回收率分別為98.91%、99.16%、100.03%、98.49%、97.91%、97.80%、99.91%、96.98%、98.65%，RSD 分別為0.98%、1.08%、0.83%、1.64%、1.13%、1.22%、0.72%、1.11%、0.81%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3 批栓劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 在紫白栓組成藥材中，乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素為紫草代表性成分，蘆薈大黃素、大黃素甲醚為大黃代表性成分，貝母蘭寧、山藥素Ⅲ為白及代表性成分。本實(shí)驗(yàn)選取上述9 種成分作為指標(biāo)，可更全面地評(píng)價(jià)紫白栓整體質(zhì)量。

3.2 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇?0.1% 磷酸［12，18］、乙腈?0.1% 磷酸［11，14］、乙腈?0.1% 甲酸［10，13，15?17］，發(fā)現(xiàn)以乙腈?0.1%甲酸洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形良好，分離度符合要求，基線平穩(wěn)，進(jìn)而對(duì)該流動(dòng)相比例不斷進(jìn)行摸索，最終確定為“2.2” 項(xiàng)下梯度洗脫程序。

3.3 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑 （95% 乙醇［13］、甲醇［14?15，18］、70% 甲醇［10?11］）、提取方式 （加熱回流提取、超聲提取［10?11，14?18］）、提取時(shí)間（15、30、60 min），發(fā)現(xiàn)以70%甲醇為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取效果最佳；加熱回流提取效果優(yōu)于超聲提??；提取30 min時(shí)各成分即可提取完全，雜質(zhì)干擾程度明顯小于提取60 min 時(shí)，同時(shí)對(duì)提取溶劑用量不斷進(jìn)行摸索。最終確定，供試品溶液制備方法為25 mL 70%甲醇加熱回流提取30 min。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm 范圍內(nèi)對(duì)各成分對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)貝母蘭寧、山藥素Ⅲ分別在274.5、270.0 nm 處有較大吸收，乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素均在275 nm 附近有較大吸收，蘆薈大黃素、大黃素甲醚均在254 nm 處有較大吸收。同時(shí)，參考2015 年版《中國(guó)藥典》紫草、大黃藥材項(xiàng)［12］及文獻(xiàn)［13?18］ 報(bào)道，分別選取275、254 nm 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單一波長(zhǎng)難以同時(shí)對(duì)各成分進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)不斷摸索，最終確定為“2.2” 項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定紫白栓中貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、乙酰紫草素、β?乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′?二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的含有量，建立了該制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量分析模式，而且該方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于其質(zhì)量控制。