比色法測(cè)定崗梅根總皂苷含量

劉群娣

廣東江門(mén)中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，廣東 江門(mén) 529000

崗梅為冬青科植物梅葉冬青Ilexasprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.的干燥根。全年均可采挖，主產(chǎn)于廣東、廣西[1]。本品性味苦寒，有清熱解毒、生津活血的功效，主治熱病、燥渴、熱瀉、咳血、喉痛等癥[2]。據(jù)廣東韶關(guān)地區(qū)藥檢所[3]113抗菌試驗(yàn)表明，崗梅根對(duì)乙型溶血性鏈球菌有輕度抑制作用，對(duì)離體豚鼠心臟注射本品，發(fā)現(xiàn)冠脈流量和心收縮力有所增加。在臨床上也有崗梅根用于防治各類(lèi)感染的報(bào)道[4]。據(jù)麥海燕等[5]對(duì)崗梅制劑的體外抗菌試驗(yàn)表明，其對(duì)上呼吸道感染常見(jiàn)致病菌有較好的抑菌作用。崗梅是常用的涼茶原料，常與其他清熱涼血的藥材配伍制成合劑使用，如著名的成藥王老吉、六合茶均以崗梅作為主要成分。

崗梅根中含有三萜皂苷(其中包括對(duì)-香豆酰三萜類(lèi)[6]、齊敦果酸和熊果酸[7])、內(nèi)酯、生物堿、氨基酸、赪酮甾醇、赪酮甾醇3-O-β-D葡萄糖苷、丁香脂素、丁香脂素-O-β-D葡萄糖苷和19-去氫烏索酸等[8]，其中皂苷類(lèi)物質(zhì)可能為本品藥理作用的基礎(chǔ)。而對(duì)于崗梅總皂苷的測(cè)定方法和結(jié)果，目前僅見(jiàn)馮達(dá)星等[9]以大孔樹(shù)脂富集純化崗梅根總皂苷。文中采取比色法作為測(cè)定方法，對(duì)崗梅根藥材的總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器和材料

TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；電子恒溫水浴鍋，汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠生產(chǎn)；OFY-500藥材粉碎機(jī)，溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)；AG285電子分析天平，Mettler toledo公司生產(chǎn)。人參皂苷Re，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110754-200320。試劑均為分析純。

崗梅根為廣州的零售藥店收集，產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 藥材編號(hào)及產(chǎn)地

將崗梅根用中藥粉碎機(jī)打碎至粉末狀，于陰涼處封裝保存，供含量測(cè)定用。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取人參皂苷Re 對(duì)照品5.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得對(duì)照品溶液，濃度為0.2080 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取崗梅根粉末約1g，用濾紙包裹，置于索氏提取器中，用20 mL甲醇冷浸過(guò)夜。將甲醇浸泡液引流入圓底燒瓶中并補(bǔ)加50 mL新鮮甲醇，回流4 h。合并提取器和圓底燒瓶中的甲醇液，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘?jiān)?5 mL蒸餾水分3次溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗。用水飽和正丁醇萃取4次，每次30 mL。合并4次正丁醇萃取液，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，制得供試品溶液。

2.3 測(cè)定方法 精密量取0.3 mL供試品溶液，置于60 ℃水浴加熱并吹干溶劑。加入0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液(新鮮配制)和0.8 mL高氯酸，蓋塞搖勻，置于60 ℃水浴加熱15 min。取出試管并立即用冰水浴冷卻，加入5 mL冰醋酸稀釋?zhuān)瑩u勻。自冰水浴冷卻算起30 min后上機(jī)測(cè)量吸光度，以545 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。每次測(cè)量并行空白，自“吹干溶劑”后平行操作。

2.4 吸收光譜的測(cè)定 取一定量的對(duì)照品溶液及按照2.2的方法制備的供試品溶液，按照2.3節(jié)的方法顯色，于400～700 nm進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液均在545 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為545 nm。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 按照最佳吸光度區(qū)間設(shè)計(jì)樣品濃度區(qū)間，取6個(gè)濃度點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測(cè)量吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、皂苷加入質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖，并計(jì)算回歸方程。其結(jié)果如圖2所示。

圖1 對(duì)照品溶液與供試品溶液的掃描圖譜(400～700 nm)

圖2 崗梅根總皂苷含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算得回歸方程為y=4.0177x-0.0023，相關(guān)系數(shù)r= 0.9996。結(jié)果表明本方法的測(cè)定范圍0.0624 ～0.1664 mg，相當(dāng)于0.3～0.8 mL對(duì)照品溶液的皂苷質(zhì)量，在此測(cè)定范圍內(nèi)，本方法具有良好的線性。

2.5.2 加樣回收試驗(yàn) 按2.2節(jié)的方法制備某濃度的供試品溶液(X液)，并向一定量的X液中加入不同濃度的對(duì)照品溶液(R液)制成混合液，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測(cè)量吸光度，以其差值為橫坐標(biāo)、加入R液的皂苷質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。其結(jié)果如表2和圖3所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)加入法的回收率測(cè)定結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

由表2計(jì)算得對(duì)照品的平均回收率為100.42%，回收率的RSD為1.83%，標(biāo)準(zhǔn)加入法所得曲線的相關(guān)系數(shù)r為0.9991。說(shuō)明對(duì)組分復(fù)雜、有雜質(zhì)存在的樣品使用本方法進(jìn)行吸光度測(cè)定，仍具有良好的線性。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)D的崗梅根粉末，精密稱(chēng)取6份，每份約1 g，按2.2節(jié)的方法制備，每份取樣0.3 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測(cè)量吸光度。測(cè)量結(jié)果如表3所示。

表3 同一批次6份供試品的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

按表3結(jié)果計(jì)算，該批次6份樣品的皂苷含量平均值為2.34%，RSD為0.76%。說(shuō)明用此法測(cè)定崗梅根總皂苷的含量精密度高，完全能滿(mǎn)足樣品分析的要求。

3 結(jié)果

藥材的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取供試品溶液0.3 mL，按2.3節(jié)的方法顯色，在545 nm下測(cè)量吸光度，測(cè)定總皂苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5批藥材的樣品測(cè)定結(jié)果(總皂苷的百分含量) (n=2)

4 討論與結(jié)論

4.1 香草醛-高氯酸是常用的皂苷顯色反應(yīng)體系。以此作為比色法的基礎(chǔ)，以人參皂苷Re、黃芪甲苷等穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)照品，在同類(lèi)分析研究中均已建立起成熟、穩(wěn)定的紫外測(cè)定方法，該法在百合[10]、酸棗仁[11]、甘草[12]、屏邊三七[13]等藥材的總皂苷含量測(cè)定中均得到深入的研究與應(yīng)用。

4.2 實(shí)驗(yàn)探索了加熱時(shí)間、加熱溫度、檢測(cè)波長(zhǎng)和檢測(cè)時(shí)間等4個(gè)對(duì)顯色測(cè)定影響較大的因素。最后選定顯色反應(yīng)條件和檢測(cè)條件為60℃加熱15 min、在545 nm下測(cè)定吸光度，放置30 min后測(cè)定，即如2.3節(jié)所述方法，在此法下方法學(xué)驗(yàn)證的穩(wěn)定性、重復(fù)性最好。

崗梅有明確的藥理活性，在廣東地區(qū)作為涼茶的主要原料已使用了幾百年。然而，崗梅并未收載到《中國(guó)藥典》(2015 年版)等國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為地方標(biāo)準(zhǔn)《廣東省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊(cè))(2004 年版)，此標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、鑒別、檢查項(xiàng)，并無(wú)含量測(cè)定內(nèi)容[3]111。比色法測(cè)定崗梅根總皂苷含量，結(jié)果良好，方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)符合要求，可作為崗梅有效部位含量測(cè)定的補(bǔ)充。通過(guò)進(jìn)一步研究，將此法擴(kuò)展到崗梅根的相關(guān)制劑的總皂苷的測(cè)定中，為崗梅根及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供更多有價(jià)值的方法與成果。