HPLC法同時(shí)測定益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的含量

王 暉 劉 敏 劉 磊 李 雪*

1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 徐州 221006;2.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004

益肺清解湯為我院自制制劑，委托江蘇省頤海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)灌裝。處方根據(jù)江蘇省中醫(yī)藥管理局印發(fā)的《江蘇省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)辯證方案(試行第一版)》的預(yù)防處方，由黃芪、蘇葉、防風(fēng)、金銀花、薄荷、麥冬、甘草七味藥制得，功效為益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪。主要用于我院醫(yī)護(hù)人員預(yù)防新型冠狀病毒使用，可提高人體正氣，抵御外邪。由于處方中黃芪為君藥，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗之功效，金銀花作為臣藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效[1]，兩藥為方中起主要作用的成分。本實(shí)驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn)和反復(fù)摸索，建立了HPLC同時(shí)測定益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的含量。該實(shí)驗(yàn)方法易于操作，專屬性、重復(fù)性和精密度均較好，測定結(jié)果可靠，可用于我院該自制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器和材料

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀(含1525型二元高效液相色譜泵、717型自動進(jìn)樣器、2847型雙波長紫外吸收檢測器和Empower色譜數(shù)據(jù)處理工作站)；日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)；上海精密科學(xué)儀器公司 FA1004B型電子天平、雷磁pHS-3B型精密pH計(jì)。

1.2 試藥與試劑 益肺清解湯樣品來自本院制劑室(江蘇省頤海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)灌裝)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：120225，純度≥98%)、綠原酸(批號：wkq07050201，純度≥98%)均購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜純、水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Waters公司Xterra?RP18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。流動相：乙腈(流動相A)-0.1%甲酸(流動相B)按照下面表1中程序進(jìn)行梯度洗脫。流速為1.2 mL·min-1，檢測波長為320 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸峰形良好，兩種成分色譜峰的理論塔板數(shù)均大于10000，與干擾峰的分離度均大于2.5，保留時(shí)間分別約為13.3 min、10.2 min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別用電子天平精密稱量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品11.57 mg、綠原酸對照品20.89 mg，置同一10 mL容量瓶中，加入50%的乙腈水溶液溶解，并滴定至刻度，搖勻，制得混合對照品儲備溶液(每1 mL中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.157 mg、綠原酸2.089 mg)，再精密量取上述對照品儲備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%的乙腈水溶液，滴定至刻度(每1 mL溶液中含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.1157 mg、綠原酸0.2089 mg)，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取益肺清解湯合劑5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%乙腈水溶液，滴定至刻度，搖勻，用濾紙濾過，續(xù)濾液再用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 按益肺清解湯處方制備缺少黃芪、金銀花藥材的陰性樣品，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得。

2.3 結(jié)果

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 在上述2.1的色譜條件下，分別取2.2中制得的供試品溶液、混合對照品溶液和陰性供試品溶液3種溶液適量，分別裝入高效液相色譜儀進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸均分離較好，無干擾，說明該實(shí)驗(yàn)建立的系統(tǒng)對成分的檢測專屬性較好。

2.3.2 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋滴定至刻度，搖勻，即得。各種濃度的對照品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積。以所含標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量X(μg)作橫坐標(biāo)，峰面積積分平均值(Y)作作縱坐標(biāo)，計(jì)算并進(jìn)行線性回歸，實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果：毛蕊異黃酮葡萄糖苷：Y=5860.32X+14.78，r=0.9999；綠原酸：Y=2816.7X+10.20，r=0.9998；表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.023～0.463 μg，綠原酸進(jìn)樣量在0.042～0.836 μg線性關(guān)系良好，符合定量要求。

2.3.3 檢測限和定量限 取2.2.1項(xiàng)下的混合對照品溶液適量，分別等倍逐級稀釋進(jìn)樣測定3次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1，計(jì)算測得檢測限分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.58 ng、綠原酸0.81 ng；當(dāng)信噪比為10:1時(shí)，得定量限分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.80 ng、綠原酸2.75 ng。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取經(jīng)2.2.1項(xiàng)方法制備的益肺清解湯(批號：2002101)供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣試驗(yàn)，分別在0、2、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸兩種成分，按色譜峰面積計(jì)算所得的RSD分別為0.32%和0.75%，說明供試品溶液在48 h內(nèi)室溫保存，溶液質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的一批益肺清解湯溶液(批號：20120210)9份，分別精密加入2.2.1項(xiàng)下制備的低、中、高3種不同濃度(相當(dāng)于供試品溶液濃度的80%、100%、120%)的混合對照品溶液，再按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，每個(gè)濃度的樣品制備3份，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密取經(jīng)2.2.1項(xiàng)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，對峰面積進(jìn)行分析計(jì)算。計(jì)算結(jié)果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.24%，結(jié)果表明使用該系統(tǒng)測量的精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取一批益肺清解湯溶液樣品(批號：2002101)6份，每份1.0 mL。按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，制得的樣品按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算，結(jié)果顯示每1 mL樣品中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷40.95 μg，RSD為0.25%；含綠原酸109.05 mg，RSD=0.38%，結(jié)果表明使用該系統(tǒng)測量的重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品測定 取樣品5批次(批號分別為2002101、2002102、2002103、2002111、2002112)，分別按2.2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算，結(jié)果益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的含量(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))結(jié)果見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 檢測成分的選擇 黃芪、金銀花為處方中的主要藥效藥材，目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中尚無對其同時(shí)進(jìn)行含量測定。藥典中黃芪以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定，金銀花以綠原酸進(jìn)行為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定，而黃芪甲苷因無紫外吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選取方中的有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行定量測定分析研究；單獨(dú)對兩種定量分析已有相關(guān)報(bào)道[2-3]，本實(shí)驗(yàn)采用一測多評法同時(shí)測定2個(gè)成分含量，更能有效控制該自制制劑的質(zhì)量。

3.2 分離條件的選擇 實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)采用了多種方法進(jìn)行成分分離[4-6]：乙腈-水梯度洗脫；乙腈-0.1%冰醋酸梯度；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為有機(jī)流動相出峰時(shí)間較長且峰較寬，分離度較差；而如果水中不加入酸調(diào)節(jié)流動性pH值的情況下綠原酸的色譜峰難以洗脫檢測出來。最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，所測的兩種成分與干擾成分得到較好的分離，保留時(shí)間也合適，峰形達(dá)到HPLC定量的要求。

3.3 檢測波長的選擇 利用紫外分光光度計(jì)對毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行吸收光譜掃描，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在259 nm和320 nm有吸收峰，綠原酸在327 nm有最大吸收峰，結(jié)合色譜圖并參考2015版《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道[7-9]，本實(shí)驗(yàn)采用320 nm作為測定波長，兩種成分均能獲得較好的信號響應(yīng)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相的方法對益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行同時(shí)測定，對色譜條件進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了同一色譜條件下的分離和含量測定。該方法操作簡單，且精密度、重復(fù)性和回收率均符合中國藥典中高效液相定量的要求，為同時(shí)測定中藥成方合劑中多成分的研究提供一定的參考，并可作為我院該自制制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。