肝癌腫瘤干細胞標志物研究進展▲

彭忠異 阮 萍 張錫流

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院病理科，廣西南寧市 530011；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西南寧市 530023)

【提要】 肝細胞肝癌(HCC)的傳統(tǒng)治療方法對晚期肝癌、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的療效較差，而腫瘤干細胞(CSCs)為肝癌的預(yù)后、診斷和靶向治療提供了新的思路。識別CSCs及其相關(guān)的治療靶點，對于提高HCC的治療效果有重要意義。

肝癌是人類最常見的癌癥之一。目前，肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的傳統(tǒng)治療方法有外科治療、放療、化療、射頻消融、肝動脈化療栓塞術(shù)、肝移植和中醫(yī)治療等，但這些治療方法對晚期肝癌、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的療效較差。隨著靶向治療的興起，腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)為肝癌的預(yù)后、診斷和治療提供了新的思路。目前，人們普遍認為CSCs參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的過程[1]，因此，識別CSCs及其相關(guān)的治療靶點對于提高HCC的治療效果有重要意義。本文對近年來肝癌腫瘤干細胞的標志物以及這些標志物在肝癌中治療意義的研究進展進行綜述。

1 腫瘤干細胞表面標志物

自從在急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn)CSCs的第一個證據(jù)以來[2]，許多腫瘤(包括肝癌)中CSCs的存在和CSCs表面標志物的鑒定已經(jīng)通過免疫原性、致瘤性或功能特征的分析進行了研究[3]。以下一些細胞表面蛋白已被鑒定為肝臟CSCs標志物。

1.1 CD133 CD133是一種五跨膜單鏈糖蛋白，分別含有兩個小的細胞內(nèi)環(huán)和兩個大的細胞外環(huán)，屬于重要蛋白家族，是造血干細胞、神經(jīng)干細胞和肝干/祖細胞的原始標記物[4]。CD133作為CSCs標志物在胃癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤組織中的作用已被證實[5]。CD133+肝癌細胞具有很強的增殖、分化和自我更新能力，成為研究腫瘤干細胞的重要靶向分子之一。CD133+腫瘤細胞在人類腫瘤細胞中僅占一小部分，但其臨床意義重大。研究表明，與低CD133表達的患者相比，高CD133表達的患者總體存活率較低，復(fù)發(fā)率較高[5]。Lin等[6]發(fā)現(xiàn)熊果酸查爾酮以劑量和時間依賴性地抑制PLC/PRF/5和Huh7肝癌細胞CD133+的表達，使其自我更新能力降低，對阿霉素和長春新堿的敏感性增強，有望成為肝癌CSCs靶向分化的有效治療劑。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，異鳥嘌呤衍生物可抑制肝癌細胞生長，特別是在CD133+亞群中，可使肝癌細胞對索拉非尼的治療更敏感。這些結(jié)果強調(diào)了靶向沉默CD133+肝CSCs以改善HCC治療結(jié)果的重要性。綜上所述，CD133作為肝癌重要的CSCs標志物之一，在肝癌等多種腫瘤中具有較強的增殖、自我更新能力，對CSCs靶向藥物的治療研究有一定的意義。

1.2 CD90 CD90(Thy-1)是卵圓細胞的表面標志，是一種分子量為25～37 kDa的糖基磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，表達于T細胞、胸腺細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等多種細胞類型。近年來，CD90作為CSCs標志物在包括肝癌CSCs在內(nèi)的多種腫瘤細胞中也受到關(guān)注。Yang等[8-9]發(fā)現(xiàn)CD90+肝癌細胞顯示出致瘤和轉(zhuǎn)移潛能，肝癌細胞系來源的CD90+細胞和肝癌患者組織/血液來源的CD45-CD90+細胞都會在免疫缺陷小鼠中產(chǎn)生腫瘤結(jié)節(jié)，從CD90+細胞衍生的異種移植在第二批和隨后的第三批免疫缺陷小鼠中均可產(chǎn)生腫瘤結(jié)節(jié)，這些結(jié)果也提示血液中存在循環(huán)中的CSCs。Yang等[9]認為，顯示出致瘤能力的是肝癌細胞株CD90+細胞而不是CD90-細胞。陳本棟等[10]也認為，CD90+細胞具有較強的侵襲能力，CD90+CSCs的潛在相互作用和離散特性對分子靶向治療具有特異性的化療敏感性和基因表達模式。近年來，越來越多的研究表明，CD90的下調(diào)可能是肝癌治療的一個潛在靶點。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CD90對HCC的特異性為91.9%，對預(yù)測低分化的敏感性為48.2%，這表明CD90對HCC的是一個有前途的靶點。

1.3 CD44 CD44是介導(dǎo)細胞和細胞外基質(zhì)之間的黏附分子家族成員，作為一種細胞表面血凝素結(jié)合糖蛋白，其位于細胞表面，與細胞骨架蛋白相互作用。CD44對組織重塑、細胞基質(zhì)黏附和細胞遷移具有重要作用，已被用作實體瘤干細胞的重要標志物。CD44現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種實體瘤中CSCs與其他細胞表面標志物的聯(lián)合鑒定。具有代表性的是，在人類乳腺癌中分離出CD44+CD24-CSCs/低細胞群體，這是在實體腫瘤中首次發(fā)現(xiàn)的[12]。在HCC方面，CD44為CD133+或CD90+CSCs群體提供了獨特的細胞特征。Zhu等[13]研究表明，與CD133+CD44-腫瘤細胞相比，CD133+CD44+腫瘤細胞具有更多的干細胞特性，包括廣泛的增殖、自我更新和產(chǎn)生分化后代的能力，并且能夠以非常低的細胞數(shù)量在NOD/SCID小鼠體內(nèi)啟動腫瘤生長。CD44可能是更有效的治療和加深對HCC進展和啟動理解的特異性靶點。Williams等[14]強調(diào)CD44調(diào)節(jié)干細胞在腫瘤進展和細胞遷移過程中的行為，除信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞-基質(zhì)相互作用外，還包括分化和自我更新。用OSKM法(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)建立了C3A來源的肝癌干細胞，命名為C3A誘導(dǎo)的CSCs；而肝癌干細胞中維持干細胞狀態(tài)的高度惡性和低分化的腫瘤細胞歸因于CD44。

1.4 上皮細胞黏附分子 上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)作為黏附分子家族中的單一跨膜糖蛋白，也被稱為CD326，其由一個大的N-末端胞外區(qū)和一個短的C-末端片段通過單個跨膜區(qū)連接而成，已被認為是分離肝干細胞的最具代表性和最成功的標志物之一[15]。EpCAM最初被確定為HCC的早期生物標記物[16]。根據(jù)對一組HCC樣本的轉(zhuǎn)錄組分析，EpCAM+肝癌顯示出肝祖細胞特征明顯的分子特征，包括存在已知的干/祖細胞標記，而EpCAM-肝癌表達的基因具有成熟肝細胞的特征[17]。此外，EpCAM+HCC表現(xiàn)出類似肝癌干細胞的特征，包括自我更新和分化，并且具有高侵襲性和致瘤性[18]，通過EpCAM+細胞亞集描述HCC的發(fā)展和侵襲性，為通過靶向β-catenin或Wnt信號成分(如EpCAM)根除HCC癌細胞開辟了一條新的途徑。進一步的研究顯示，與CD90+HCC相比，EpCAM+HCC與低分化、高血清甲胎蛋白水平和低遠處器官轉(zhuǎn)移發(fā)生率高度相關(guān)[19]。從機制上講，EpCAM作為Wnt-β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶基因[20]，可能通過促進Wnt-β-catenin信號拮抗劑對患者的藥理反應(yīng)來改善HCC的預(yù)后。同時，EpCAM還通過調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解介導(dǎo)C-末端片段釋放來激活Wnt/β-catenin信號[21]。

1.5 CD13 CD13也被稱為氨基肽酶N，是一種分子量150 kDa的膜表面糖蛋白，具有CSCs特性，在腫瘤的侵襲、血管生成和細胞增殖等過程中起重要作用，在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，如細胞增殖、癌灶內(nèi)細胞簇的形成以及治療過程中的生存能力[22]。最近在人肝癌細胞系和臨床標本中發(fā)現(xiàn)CD13是一種新的細胞表面標志物，CD13+CSCs與臨床肝癌標本中的缺氧標志有關(guān)。這提示CD13+CSCs在HCC的腫瘤增殖和抗腫瘤治療中起主導(dǎo)作用[23]。Haraguchi等[24]采用Hoechst染料排斥法，發(fā)現(xiàn)CD13在人肝細胞癌中以半液態(tài)CSCs亞群的形式表達。CD13+細胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)具有較高的致瘤潛能，并對化療藥物阿霉素和5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出耐藥性。CD13抑制劑烏苯美司可降低G0/G1期細胞比例，烏苯美司通過提高細胞內(nèi)活性氧水平，促進細胞凋亡，提高5-氟尿嘧啶、順鉑和DXR的治療效果[25]。Martin-Padura等[26]通過原位注射表達人甲胎蛋白和/或熒光素酶的肝癌細胞系和原代肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)CD13+細胞處于微小殘留病狀態(tài)，這也表明靶向處于休眠狀態(tài)的CSCs是治療成功的關(guān)鍵。

1.6 CD24 CD24編碼唾液酸糖蛋白并在成熟的粒細胞和B細胞中表達，同時調(diào)節(jié)這些細胞的生長和分化信號。CD24在人類各種癌癥中也經(jīng)常過度表達，并與不良預(yù)后相關(guān)。CD24是一種高度糖基化的小黏蛋白樣細胞表面糖蛋白，在祖細胞或干細胞中表達。CD24+肝癌細胞對患者的臨床預(yù)后有很大影響，在腫瘤的自我更新、分化、維持和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[27]。Liu等[28]證實CD24作為肝癌干細胞的功能性標志物，利用STAT3介導(dǎo)的NANOG調(diào)控來推動肝癌干細胞的形成。 Twist2作為高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，對以CD24為基礎(chǔ)的增強型肝癌干細胞的自我更新具有重要意義。Twist2-CD24-STAT3-NANOG通路可能在肝癌干細胞自我更新調(diào)控中起關(guān)鍵作用。近年來，靶向CD24已成為改善肝癌患者預(yù)后的一種新的靶向治療方法。Zheng等[29]發(fā)現(xiàn)NDRG2(N-Myc下游調(diào)節(jié)基因2)通過調(diào)節(jié)CD24發(fā)揮抗癌活性。在肝癌細胞中，通過劑量和時間依賴的方式發(fā)現(xiàn)黃芩素可顯著降低c-Myc的表達，而c-Myc是細胞生長、凋亡和細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Han等[30]研究證實了黃芩素對肝癌細胞的有效抗腫瘤作用，提示黃芩素通過下調(diào)CD24來抑制細胞增殖和細胞存活。

2 腫瘤干細胞其他標志物

2.1 細胞質(zhì)中的標記

2.1.1 OV6 肝卵圓細胞為位于肝臟門脈區(qū)域的肝干/祖細胞，具有雙潛能，可分化為肝細胞和膽管細胞[31]。OV6是一種肝臟祖細胞/干細胞標記物，最近被確認為CSCs的推定標記物[32]。研究證實OV6+肝癌細胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)具有較高的成瘤能力和對標準化療的耐藥性[33]。此外，激活Wnt通路可增加OV6+細胞水平，抑制β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)會導(dǎo)致OV6+細胞比例下降。CD133+在OV6+細胞中的表達明顯富集，表明OV6+是一個潛在的CSCs標記物。Yang等[34]提出了利用磁珠分離方法從肝癌細胞系SMMC7721和Huh7中分離出OV6+細胞，發(fā)現(xiàn)這些OV6+肝癌細胞不僅在體外具有較強的自我更新能力和致瘤性，在NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植的OV6+肝癌細胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出較強的侵襲力和轉(zhuǎn)移潛能。此外，OV6+腫瘤細胞高表達與侵襲性臨床病理特征及預(yù)后不良有關(guān)，在OV6+細胞中，CXCR4過表達，SDF1上調(diào)可導(dǎo)致OV6+HCC細胞數(shù)量增加，特異性CXCR4抑制劑(AMD3100)或針對CXCR4的siRNA轉(zhuǎn)染可阻斷SDF1的作用。提示OV6+肝癌細胞具有自我更新能力、致瘤性和侵襲性，腫瘤內(nèi)OV6的表達受Wnt/β-catenin和SDF1/CXCR4信號通路的調(diào)控。由此提示，OV6+細胞在HCC的轉(zhuǎn)移和進展中起重要作用。此外，CXCR4/SDF1軸提供了消除肝臟致瘤的治療靶點。

2.1.2 乙醛脫氫酶 在人體的腎、肝細胞中，乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)作為一種解毒酶，可促進乙醛和乙醇代謝。ALDH是一種普遍存在的胞內(nèi)酶，可催化多種細胞醛類的不可逆氧化。ALDH+細胞在乳腺癌、肝癌和急性髓系白血病等腫瘤組織中已被檢測到，根據(jù)其增殖率、遷移和黏附能力而被認為是CSCs。ALDH+細胞的轉(zhuǎn)移潛能高于ALDH-細胞，同時還促進了癌癥的化療耐藥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[35]。流式細胞儀測定高水平的ALDH可能是正常肝臟中的肝祖/干細胞和肝癌中CSCs的一個標志物[36]。Ma等[37]分析了幾種不同的ALDH亞型在肝細胞系中的表達和ALDH酶活性，他們通過雙色流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)ALDH與CD133的表達呈正相關(guān)，且大多數(shù)ALDH+肝癌細胞表現(xiàn)出CD133+，但并不是所有的CD133+HCC細胞都是ALDH+，而CD133+ALDH+細胞明顯比其他細胞更具致瘤性。這些數(shù)據(jù)表明，ALDH結(jié)合CD133可以更特異地標記致瘤CSCs。最近，Chiba等[38]通過激活ROS-p38MAPK通路，提示ALDH的小分子抑制劑可下調(diào)CSCs標志物的數(shù)量，抑制肝癌細胞的自我更新能力。此外，最近發(fā)現(xiàn)ALDH1A1的作用在HCC中得到了表現(xiàn)，其屬于ALDH1家族的一個成員，由視黃烯合成視黃酸(retinoic acid，RA)，是RA信號通路的重要調(diào)節(jié)因子[39]。RA誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如細胞增殖、分化、細胞周期停滯和凋亡[40]。由于這些“莖性”的特征，ALDH1家族被認為是干細胞標記物[41]。

2.1.3 CK19 細胞角蛋白是一種典型的上皮細胞標記物， CK19是膽管細胞、肝祖細胞和早期肝母細胞的標志物，在正常人肝膽管細胞中表達，也散布于肝硬化和肝癌實質(zhì)中[42]。CK19是HCC侵襲性強、預(yù)后差的標志物，與CK19陰性的HCC相比，CK19常與預(yù)后不良以及mRNA和上皮-間葉轉(zhuǎn)換(epithelial mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白有關(guān)，CK19陽性的HCC顯示出更頻繁的主要血管侵犯[43]。CK19+在HCC中是一種干細胞性標志物，與侵襲力、腫瘤大小、腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和微血管浸潤相關(guān)性強，是預(yù)測預(yù)后、患者生存和腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素[43]。在CK19+肝癌細胞中，EMT相關(guān)蛋白表達增加，在腫瘤細胞侵襲過程中起主導(dǎo)作用[43]。研究還發(fā)現(xiàn)，超過90%的CK19+HCC細胞表達至少一個其他與干細胞相關(guān)的標記物，相比而言，EpCAM、c-kit和CD133單獨表達的頻率更高，這意味著CK19可能比其他標記物更“特異”地與干細胞相關(guān)。Kawai等[44]研究結(jié)果表明，CK19+細胞在體外具有較高的增殖能力和5-氟尿嘧啶抗性，提示CK19+細胞參與了Smad/TGFb信號和EMT的激活，這些特性可被TGFBR1抑制劑或CK19基因敲除所抑制。作為一個與Smad/TGFb信號和EMT相關(guān)的新的CSCs標記物，CK19被認為是抑制TGFBR1的良好治療靶點。

2.2 細胞核中的標記

2.2.1 Nanog Nanog基因是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源盒家族中的一員，最近在多能性促進基因的篩選中被發(fā)現(xiàn)。越來越多的證據(jù)表明，Nanog在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。功能喪失的相關(guān)研究表明，Nanog對上皮性惡性腫瘤的數(shù)量至關(guān)重要，部分原因是通過調(diào)節(jié)CSCs數(shù)量[45]。Nanog在實體瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸部鱗狀細胞、肝細胞癌、肺癌及前列腺癌中的表達水平均上調(diào)[46-47]，提示Nanog可能在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮潛在作用。肝癌細胞中的Nanog通過激活Nodal/Smad3信號通路促進EMT和細胞侵襲，高表達的Nanog會導(dǎo)致低表達的Huh7肝癌細胞的細胞侵襲力增加，并誘導(dǎo)具有Vimentin+/ Ecadherin-特征的EMT出現(xiàn)[48]。通過HepG2細胞系實驗，Zhou等[49]發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白誘導(dǎo)Nanog表達后，磷酸化的STAT3蛋白表達增強，這種作用可通過抑制STAT3磷酸化而減弱。Yin等[50]研究提示Oct4和Nanog的共同表達與HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后和耐藥密切相關(guān)，隨后的分子機制研究揭示了Oct4/Nanog調(diào)控的EMT通過STAT3依賴的Snail激活而改變。此外，STAT3的下調(diào)還抑制了Oct4/Nanog介導(dǎo)的EMT在HCC中的變化和侵襲/轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)為治療具有CSCs樣信號和EMT表型的HCC的進展和轉(zhuǎn)移提供了一個新的治療靶點。

2.2.2 SOX9 SOX9是SRY基因超家族的成員，是一些惡性腫瘤的原癌基因，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、腸癌和胃癌[51-52]。通過上調(diào)Oct4，SOX9參與了癌癥干細胞樣特性的維持，包括自我更新、化療耐藥和致瘤性[53]。Guo等[54]首先分析了SOX9蛋白和mRNA在人肝癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)SOX9與患者的臨床預(yù)后有關(guān)。SOX9在腫瘤分期越高、無瘤生存期越短、總生存期越短的腫瘤組織中表達越強。進一步研究表明SOX9指導(dǎo)的調(diào)節(jié)子miR101是潛在HCC的腫瘤抑制因子miRNA[55]，他們還發(fā)現(xiàn)靶標miR-101下調(diào)了SOX9的水平，這也得到了基因分析的證實，表明miRNA-101直接針對HCC組織中的SOX9。siRNA增強miR-101的表達和抑制SOX9的表達，不僅抑制了肝癌細胞的增殖，而且抑制了肝癌細胞的體外致瘤性。

3 肝癌腫瘤干細胞的靶向治療

肝癌是一種高度惡性的腫瘤，在侵襲性、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移上呈現(xiàn)較強的能力，發(fā)展到中晚期往往預(yù)后不良。傳統(tǒng)治療方法如外科手術(shù)、內(nèi)科化療、放療及中醫(yī)療法對晚期、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的肝癌患者效果較差，這可能與肝臟CSCs的存在有關(guān)，去除肝癌CSCs則為治療肝癌的新路徑。目前基于肝癌腫瘤干細胞的靶向治療顯示出巨大潛力，靶向藥物研究有一定的意義和成效，但大多仍然停留在科研及實驗階段。在實際靶點治療肝癌中，仍不能徹底消滅癌細胞，未能阻止肝癌的發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。所以，在實際臨床治療方面還存在下述等待解決的問題：(1)肝癌CSCs的各種生物學(xué)特性有待不斷闡明；(2)肝癌CSCs與正常干細胞存在許多相似性，如何提高靶向治療的特異性，是需要解決的問題。

4 小結(jié)與展望

肝癌CSCs標志物除上述[CD133、CD90、CD44、EpCAM(CD326)、CD13、CD24、OV6、ALDH1、CK19、Nanog、SOX9]標志物外，仍有Nestin、CD47、GST-P等多個肝癌CSCs標志物被報道。肝癌CSCs標志物是研究肝癌CSCs的切入點，肝癌CSCs標志物的研究可為肝癌的靶向治療開辟新的道路。雖然目前尚停留在初級階段，隨著研究的深入以及各項瓶頸的突破，比如肝癌CSCs生物學(xué)特性的不斷闡明，可研發(fā)出針對肝癌CSCs特異性靶點的藥物，在消除肝癌CSCs的同時，對正常細胞無不良影響, 使明顯提高肝癌的治療效果成為可能。