滇重樓辣椒輕斑駁病毒分離物的鑒定及全基因組序列分析

楊林毅 陳潞 陳澤歷

摘要：滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）是多年生草本植物，其藥用部位為地下根莖，是一種重要的中藥材。為明確侵染滇重樓的病毒病原，對采自云南省曲靖市的滇重樓進(jìn)行透射電鏡觀察、DAS-ELISA和RT-PCR技術(shù)檢測。在透射電鏡下觀察到桿狀病毒粒子，大小為（200～300） nm×（20～36） nm。對采集到的7份病樣進(jìn)行DAS-ELISA檢測，結(jié)果表明，其中5份病樣呈陽性。通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增、克隆獲得1個全長為6 357 bp的曲靖分離物PMMoV-QJ的全基因組序列。將PMMoV-QJ的全基因組序列與國內(nèi)外已經(jīng)報道的10個PMMoV分離物進(jìn)行同源性分析比對，其同源性為99.42%～99.81%?；谌蛐蛄械南到y(tǒng)發(fā)育分析表明，PMMoV-QJ與韓國分離物親緣關(guān)系密切。本研究明確了該分離物的親緣關(guān)系，從分子水平鑒定該分離物，為后續(xù)滇重樓病毒病的預(yù)防提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）;辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）;鑒定;序列分析

Abstract： Paris polyphylla var. yunnanensis is a perennial herb， and its medicinal part is underground rhizomes. It is an important chinese medicinal material. In order to clarify the viral pathogens infecting the Paris polyphylla， the transmission electron microscopy， DAS-ELISA and RT-PCR techniques were performed on the Paris polyphylla collected from Qujing， Yunnan province. Baculovirus particles were observed under transmission electron microscopy and were（200～300）nm ×（20～36）nm in size. The results of DAS-ELISA on 7 samples collected showed that 5 of them were positive. A whole genome sequence of a 6 357 bp Qujing isolate （PMMoV-QJ， accession number MK784568） was cloned by RT-PCR amplification. The homologous sequence of PMMoV-QJ were analyzed by homology with 10 PMMoV isolates reported at home and abroad， and the homology was between 99.42% and 99.81%. Phylogenetic analysis based on the whole gene sequence showed that PMMoV-QJ was closely related to Korean isolates. This study clarifies the genetic relationship of the isolate， and identifies the isolate from the molecular level， which provides a theoretical basis for the prevention of the subsequent viral disease.

Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis; pepper mild mottle virus（PMMoV）; identification; sequence analysis

滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）又稱獨角蓮，屬延齡草科重樓屬（Paris）多年生草本植物，其藥用部位為地下根狀莖，分布于亞歐大陸溫帶和熱帶地區(qū)，在中國主要集中在西南地區(qū)，其中以云南省滇中、滇東和滇東北、滇西和滇西北為主[1]。滇重樓宜陰畏曬，喜濕忌燥，通常生長在氣候濕潤、雨量適當(dāng)、海拔1 300～3 000 m的蔽陰處。作為一種珍稀中草藥，滇重樓以根莖入藥，其主要化學(xué)成分為甾體皂苷，并含多糖、黃酮苷、β-脫皮激素及氨基酸，具有較強生物活性，有抗微生物、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、消腫止血、清熱解毒、涼肝定驚等功效，是云南白藥、樓蓮膠囊、宮血寧膠囊等云南品牌中成藥的主要原料植物之一[2]。由于長期對野生滇重樓掠奪式的采挖，加之滇重樓自然繁殖率低，生長緩慢且周期長，野生滇重樓出現(xiàn)嚴(yán)重緊缺現(xiàn)象，現(xiàn)在已成為云南省30種稀缺瀕危天然藥物之一。野生滇重樓很少發(fā)生病蟲害，然而隨著滇重樓規(guī)?；斯しN植的發(fā)展及栽培年限的增加，新的病害不斷出現(xiàn)，加之滇重樓種植于灌溉方便、地勢平坦且排水良好的酸性土壤中，土壤肥沃疏松、有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)含量較高，為種植滇重樓提供了良好條件，但同時也加劇了病害的發(fā)生。這些病害的發(fā)生對滇重樓的產(chǎn)量和品質(zhì)造成不同程度的影響，輕者減產(chǎn)、重者絕收，使農(nóng)戶遭受損失。目前報道的滇重樓病害多為真菌性病害，包括根腐病、莖腐病、葉斑病、葉枯病、猝倒病等和細(xì)菌性病害，細(xì)菌性病害主要是細(xì)菌性穿孔病[3]，關(guān)于病毒病害報道較少。

辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的正義鏈RNA病毒，基因組RNA由6 356或6 357個堿基組成，編碼病毒復(fù)制酶蛋白P126和P183、運動蛋白（MP）和外殼蛋白（17kDa）等至少4種蛋白，是世界范圍內(nèi)造成辣椒經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一[4，5]。PMMoV可以通過種子和汁液摩擦傳播，帶毒種子、發(fā)病植株和病土是重要的侵染來源。在自然條件下，病毒可感染所有辣椒品種，包括甜椒品種和辣椒，還可以通過機(jī)械接種感染茄科、藜科和莧科的部分宿主。PMMoV最早報道于美國辣椒[6]，1994年在中國新疆辣椒上被首次發(fā)現(xiàn)[7]。感病辣椒葉片呈現(xiàn)斑駁、花葉、扭曲或皺縮癥狀，莖稈上出現(xiàn)褐色壞死斑，果實變小畸形、果面斑駁或出現(xiàn)凹陷壞死等明顯病毒病癥狀，后期辣椒果實外觀和內(nèi)在品質(zhì)均顯著變差。到目前為止還沒有關(guān)于該病毒感染滇重樓的報道。近年來，發(fā)現(xiàn)云南曲靖地區(qū)出現(xiàn)了病毒性病害。本研究采用反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）等技術(shù)對云南省曲靖地區(qū)滇重樓的病毒病進(jìn)行克隆和序列分析，明確該分離物的親緣關(guān)系，從分子水平鑒定該分離物，為后續(xù)滇重樓病毒病的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

本研究在云南省曲靖市進(jìn)行采樣調(diào)查，采集病樣具有花葉、斑駁和退綠癥狀。病樣于-80℃保存。

供試PMMoV的DAS-ELISA的檢測試劑盒購自Creative Diagnostics公司，植物總RNA提取試劑盒（OMEGA.Plant RNA Kit）購自昆明碩陽科技公司，Prime ScriptTM Ⅱ Ist Strand cDNA Synthesis Kit合成試劑盒購自TaKaRa生物工程（大連）有限公司，Power Taq PCR Master Mix試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 電鏡觀察

取退綠癥狀明顯的滇重樓病葉進(jìn)行病毒粒子提純，病毒粒子提純參照Zhao等[8]描述的方法，提純的病毒粒子用浸出法在電子顯微鏡下觀察。用鋪有Formver膜的電鏡銅網(wǎng)沾取病毒粗提純液，用吸水紙吸干，加1滴2%磷鎢酸（pH 7.0）負(fù)染1 min然后吸干，待干燥后用JEM-1200EXII透射電鏡觀察，并用GATAN CCD相機(jī)拍照。

1.3 血清學(xué)檢測

取田間采集到的滇重樓疑似感染病毒病葉，加入PBS緩沖液進(jìn)行研磨裂解后，采用DAS-ELISA法進(jìn)行檢測。檢測方法按Pepper mild mottle virus （PMMoV） ELISA Kit（DEIAPV220）試劑盒說明書進(jìn)行（Creative Diagnostics），以健康滇重樓葉片為陰性對照，以緩沖液為空白對照。

1.4 滇重樓葉片總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取2份癥狀較明顯的滇重樓病葉，以1份健康的滇重樓葉片為對照提取總RNA。具體方法按照OMEGA.Plant RNA kit試劑盒說明書進(jìn)行，將提取得到的總RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。提取得到的總RNA作為模板用于cDNA第一鏈合成，總反應(yīng)體系20 mL：Total RNA 4 mL，下游引物2.5 mL，dNTP Mixture（10 mmol/L each）1 mL，ddH2O 2.5 mL，混勻，65 ℃溫度育5 min，置于冰上急冷，加入5?Prmine ScriptⅡ Buffer 4 mL，Prime ScriptⅡTase 1 mL，RNase Inhibitor（40 U/mL） 0.5 mL，RNase Free dH2O 4.5 mL，42 ℃退火90 min，72 ℃終止反應(yīng)15 min，在4 ℃保存條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增，采用2×Power Taq PCR Master Mix試劑盒，反應(yīng)體系參照廠家說明書，擴(kuò)增體系50 mL，擴(kuò)增反應(yīng)體系為2?Power Taq PCR Master Mix 25 mL，上游引物（TobUni1）5 mL，下游引物 （TobUni2） 5 mL，cDNA模板 2 mL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)擴(kuò)增，72 ℃終止延伸8 min，最后凝膠電泳檢測。

1.5 基因組克隆及分析

根據(jù)GenBank中PMMoV中國分離物PMMoV-CN（登錄號AY859497）的基因序列設(shè)計3對特異性引物[9]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

將PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳并切膠回收后直接克隆于載體pGEM-T Easyvector （Promega），總反應(yīng)體系：2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，PGEM-T Easy Vector 1 μL，切膠回收產(chǎn)物3 μL，T4 DNA Ligase? ? ?1 μL。將配制好的連接體系輕輕混勻，在室溫靜置1 h或者4 ℃條件下靜置過夜用于轉(zhuǎn)化DH5α。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α在含50 ng/μL氨芐青霉素的平板上培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取藍(lán)斑（對照）白斑進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。將篩選出的含重組質(zhì)粒的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用DNAMAN軟件及BLAST（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列分析，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓病毒樣品田間癥狀

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病滇重樓葉片呈現(xiàn)退綠、花葉、黃化或皺縮等明顯的病毒病癥狀（圖1）。

2.2 電鏡觀察病毒粒子形態(tài)

取呈現(xiàn)退綠癥狀明顯的滇重樓病葉進(jìn)行病毒粒子提純，提純的病毒粒子在透射電鏡下觀察到桿狀病毒粒子，大小為（200～300） nm×（20～36） nm（圖2）。

2.3 DAS-ELISA血清學(xué)檢測

對采集到的7份病樣進(jìn)行DAS-ELISA檢測，結(jié)果表明，其中5份病樣呈陽性（表2）。

2.4 PMMoV-QJ RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用PMMoV特異性引物分別為PMMoV1F、PMMoV1R、PMMoV2F、PMMoV2R、 PMMoV3F和PMMoV3R。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到3段單一的PCR產(chǎn)物。

2.5 PMMoV-QJ的全基因組測序

對3段單一的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過DNAMAN軟件拼接獲得PMMoV-QJ（登錄號MK784568）的基因組序列全長為6 357 bp。PMMoV-QJ的全基因組序列包含1 880個堿基A、? ? ? 1 526個堿基G、1 779個堿基T和1 172個堿基C，這4種堿基在PMMoV-QJ的全基因組序列中所占的百分比依次為29.57%、24.01%、27.98%和18.44%。5′-非編碼區(qū)（5′-UTR）和3′-非編碼區(qū)（3′-UTR）分別含有69和199個堿基。PMMoV-QJ有4個開放閱讀框架，編碼4個蛋白，分別為126 kDa蛋白（70-3 423 nt）、183 kDa蛋白（70-4 908 nt）、28 kDa蛋白（4 909-5 682 nt）和17 kDa蛋白? ?（5 685-6 158 nt）。第一個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒復(fù)制相關(guān)，同時第一個開放閱讀框與第二個開放閱讀框共同編碼一個與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，第三個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒移動有關(guān)，第四個開放閱讀框編碼的蛋白為病毒衣殼蛋白。