養(yǎng)分增加對藍(lán)莓根部真菌群落的影響

何逸菲 唐卓菲 黃昕怡 顏 勁 吳朱杰KABORE Marthur Fabrice 孫立夫 張艷華

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

高等植物與土壤真菌常形成互利共生的菌根[1]，杜鵑花科(Ericaceae)植物具有特殊的杜鵑花類菌根(歐石楠類菌根ericoid mycorrhiza，ERM)，在土壤礦化率低、營養(yǎng)貧瘠的惡劣生境條件下能促進(jìn)宿主對營養(yǎng)元素，尤其是氮(N)和磷(P)的吸收[2-3].然而，隨著工農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展，全球的N沉降逐漸增多[4]，N沉降的加劇使得生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)發(fā)生了極大的改變.杜鵑花科植物在N豐富的條件下生長緩慢，甚至不生長[5-6]，高水平的N沉降使荷蘭和部分英國歐石楠荒地的優(yōu)勢種由原來的杜鵑花科植物向草本植物方向演替[7]，但是P缺乏減緩了演替過程[8].植物凋落物是森林土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的主要來源，也是植物與土壤間C、N循環(huán)的重要途徑[9]，決定著土壤有機(jī)N庫的大小[10].營養(yǎng)元素特別是P的有效性對調(diào)節(jié)植物凋落物分解速率和生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要作用[11].在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，N、P和凋落物的輸入不僅能導(dǎo)致地上植物群落發(fā)生演替，也是地下根部真菌群落演替的驅(qū)動力.

杜鵑花科植物長期適應(yīng)貧瘠的生長環(huán)境，養(yǎng)分增加對其根部真菌侵染和ERM真菌群落是否產(chǎn)生影響還知之甚少.本文以盆栽杜鵑花科的藍(lán)莓為研究對象，通過設(shè)置不同N、P和凋落物濃度梯度，經(jīng)過培養(yǎng)，收集不同處理下藍(lán)莓的毛根，比較其根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu).并通過生態(tài)化學(xué)計量學(xué)特征的研究，建立藍(lán)莓菌根真菌多樣性與土壤營養(yǎng)元素之間的關(guān)系，探索N、P和凋落物對藍(lán)莓根部真菌群落的影響，以期為養(yǎng)分增加對藍(lán)莓等杜鵑花科植物及其根部真菌群落動態(tài)影響的研究提供一定的理論依據(jù).

1 研究方法

1.1 樣品培養(yǎng)與采集

在紹興文理學(xué)院的溫室中培養(yǎng)具有代表性的ERM植物——越橘屬(Vaccinium)的藍(lán)莓(組培的3年生苗木)，通過施加不同濃度梯度的N、P養(yǎng)分、不同質(zhì)量的杜鵑花植物的葉片凋落物(NH4Cl-N分別為10、50和120 kg N/hm2·a，NaH2PO4-P分別為10、30和50 kg P/hm2·a，以毛杜鵑葉片作為凋落物分別為0.5、1和2 kg/m2·a)，以及中倍量的N與L、N與P混合處理，4個月后各選取3個樣株，共采集藍(lán)莓毛根樣品和土壤樣品各36個.

1.2 樣品的處理及分析

1.2.1 藍(lán)莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

采集藍(lán)莓植株毛根，經(jīng)過一系列處理后，進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并確定有擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA樣品，低溫保存，送至生物公司待測，Illumina Miseq PE250/PE300測序：每樣品PCR產(chǎn)物大小在300～500 bp，引物為ITS1F-ITS2R.數(shù)據(jù)抽平后，每個樣本均有51 462條reads[12].

1.2.2 元素含量測定

將土壤烘干、研磨、過篩.精確稱取樣品0.5 g，硝化處理后，在比色管中加雙蒸水定容至10 mL，用美國利曼Prodigy XP型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定樣品中P、K、Mg、Mn和Cu元素的含量.精確稱取樣品15 mg，錫箔紙包埋后，用Vario ELⅢ元素分析儀測定C和N的含量，并計算C/N和N/P.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 13.0呈現(xiàn)，SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，r軟件包進(jìn)行分析及繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同養(yǎng)分處理下土壤中各元素含量的比較

將測量和計算后的部分元素含量和C/N列于表1.

由表1可知，與對照組相比，添加不同濃度N的土壤中Cu含量和C/N都有顯著差異(p≤0.05)，P含量有極顯著差異(p≤0.01)；添加不同濃度P的土壤中，P和Mn含量都有顯著差異(p≤0.05)；添加不同計量凋落物的土壤中，只有K含量有顯著差異(p≤0.05)，其余元素含量之間均無顯著差異(p>0.05).

添加N、P、凋落物和NP、NL混加的處理組的P、K、Mg、Mn和Cu含量都高于對照組.說明藍(lán)莓生長過程中需要適當(dāng)添加養(yǎng)分，對土壤中元素含量的保持有利.

2.2 不同養(yǎng)分處理下藍(lán)莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

將高通量測序檢測結(jié)果的分類學(xué)信息進(jìn)行綜合，與真菌基因庫比對后發(fā)現(xiàn)，所有處理組的真菌分屬于4個門，即Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota和unclassified_k_Fungi(未被鑒定的真菌).添加P和凋落物的藍(lán)莓根部真菌群落的組成中目、科、屬、種各分類水平的數(shù)目均比其他處理組高出2～3倍.由Venn圖1可知，CK、P、凋落物和N處理組的藍(lán)莓根部的操作分類單元OTU(Operational Taxonomic Units，相似水平≥97%)分別為59、140、188和81，而共有的OTU為30，其中凋落物和P處理組的特有真菌種類更多，分別為89和46.用Alpha豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，sobs、chao和ace豐度指數(shù)顯示，添加的凋落物越高，藍(lán)莓根部真菌群落的豐度越高，而N和P的濃度越高，真菌群落的豐度越低.由shannon和simpson多樣性指數(shù)可知高N、高L、中P處理組真菌多樣性更高.總體而言，凋落物的添加和NP混合添加對藍(lán)莓根部真菌的多樣性具有更明顯的促進(jìn)作用.與同屬的野生越橘屬植物根部真菌相比，盆栽的藍(lán)莓根部真菌物種多樣性水平不高,僅有346個OTU，如Vacciniumcarlesii5 595 個OTU[12]和V.mandarinorum1 216個OTU[13].

表1 養(yǎng)分增加后土壤中各元素的變化

以藍(lán)莓根部真菌群落中目水平的物種構(gòu)建真菌群落結(jié)構(gòu)見圖2，僅高L1、高L2、高N3和低P3樣本主要是由Sebacinales和GS34組成，其余各組均主要由Archaeorhizomycetales和Sebacinales組成，說明不同養(yǎng)分添加，短期內(nèi)各處理組的根部真菌群落的結(jié)構(gòu)在目水平上都具有較高的相似性.用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，對3個高倍量處理組和對照組的OTU水平進(jìn)行分析，見圖3.主成分PC1和PC2分別為67%和14.69%，高倍量N、P、凋落物和對照組之間的OTU組成和結(jié)構(gòu)差異明顯，在第一主成份中高倍量N和凋落物與高倍量P和CK有明顯區(qū)分，說明添加不同的元素，藍(lán)莓植株的菌根生長過程中共生有不同的真菌；第二主成分中，高倍量N和凋落物之間并未明顯劃分，說明這兩者添加后根部菌根共生的真菌相似性很高.營養(yǎng)元素和凋落物的添加會適當(dāng)改變藍(lán)莓根部內(nèi)生菌的組成和結(jié)構(gòu).這種作用在較短的時間內(nèi)有顯現(xiàn)，長期作用的效果還需進(jìn)一步觀察和檢測.

圖1 各處理的藍(lán)莓植株根部真菌OTU(CK：對照組；N、L、P：分別添加N、L、P)

圖2 各處理組根部真菌群落組成(目水平)

圖3 藍(lán)莓根部真菌群落(OTU水平)組成的排序圖

2.3 藍(lán)莓根部真菌與土壤因子之間的關(guān)系

將各處理的藍(lán)莓根部真菌豐度排前30的OTU與土壤元素含量和元素計量比進(jìn)行spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見圖4.公認(rèn)的ERM真菌的有4個，其中OTU11為子囊菌的Oidiodendronmaius[14-15]與Mn呈顯著正相關(guān)，其他3個即OTU22、OTU31和OTU33都是擔(dān)子菌的Sebacinales真菌目的成員，與多種元素含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，Sebacinales的部分成員在全球范圍內(nèi)杜鵑花植物根中普遍存在[16-18].說明土壤中營養(yǎng)元素含量高不利于其ERM功能性真菌的定殖.

將土壤元素和元素計量比與中等水平處理的各組和對照組藍(lán)莓樣本及其根部真菌群落(豐度前30的OTU)進(jìn)行冗余分析RDA(Redundancy analysis)，即環(huán)境因子約束化的主成分分析，見圖5，中N處理的藍(lán)莓樣本和真菌群落都與N/P呈正相關(guān)，中N和中NL樣本都與K、Mg、Mn和C/N都呈負(fù)相關(guān)，而中P和中NP的樣本和真菌群落都與C、N和N/P呈負(fù)相關(guān)，從圖5可以看出，除P元素外其他的土壤元素含量和元素計量比的影響都比較大.中等水平的凋落物處理組和CK組的各樣本和真菌群落沒有明顯的相關(guān)性.進(jìn)一步說明不加養(yǎng)分或者是仿照自然生態(tài)系統(tǒng)僅添加凋落物(緩慢分解釋放的養(yǎng)分)可能更加有利于藍(lán)莓根部真菌群落的建立，全球N沉降可能是導(dǎo)致杜鵑花科植物的菌根真菌減少，進(jìn)而發(fā)生地上部分衰退的一個重要原因.

圖4 Spearman相關(guān)性熱圖(*0.01

圖5 土壤因子、真菌群落和樣本之間的關(guān)系

3 結(jié)論

養(yǎng)分增加對藍(lán)莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生影響，添加凋落物的處理組根部真菌豐度最高，而添加N和P越多，真菌群落的豐度越低；公認(rèn)的ERM真菌Oidiodendronmaius與Mn呈顯著正相關(guān)，而Sebacinales與多種元素含量，特別是P呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；RDA分析顯示僅添加凋落物或者不添加養(yǎng)分的藍(lán)莓根部真菌群落與土壤主要元素和元素計量比沒有相關(guān)性.總之，加N和加P不利于藍(lán)莓根部物種豐富度的增加和ERM功能性真菌在群落中的建立.