多穗柯提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選*

方海蓮，劉妹玲，李詩(shī)瑤，肖竹平

(吉首大學(xué)民族藥解析與創(chuàng)制湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000)

糖尿病是一種常見的代謝性內(nèi)分泌疾病，因?yàn)橐葝u素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致，其中95%以上為2型糖尿病[1-2].糖尿病是目前醫(yī)治成本最高、負(fù)擔(dān)最重的慢性病之一，并且可引發(fā)多種并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病視網(wǎng)膜病變等[3-4].國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，目前全球有4.63億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2030年，糖尿病患者總數(shù)將增至5.78億[5].α-葡萄糖苷酶是一類主要分布于小腸粘膜刷狀緣上、能斷裂非還原末端的α-葡萄糖苷鍵、水解食物中二糖及多糖的常見酶.通過抑制α-葡萄糖苷水解酶的作用，能有效減少或抑制糖類的水解，延緩糖類的吸收，從而降低血糖濃度[6-7].目前臨床治療糖尿病的方法幾乎都是利用藥物來降低血糖含量.如二甲雙胍、磺酰脲類、阿卡波糖等藥物，雖然控制血糖的效果很好，但是往往不能治療由糖尿病引發(fā)的各種并發(fā)癥，而且這類藥物通常會(huì)有嚴(yán)重的副作用，長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)患者的機(jī)體造成一定的損害及耐藥性[8-11].作為另一種選擇，已有越來越多的專業(yè)人士在探索利用天然產(chǎn)物來預(yù)防和治療糖尿病.天然產(chǎn)物雖然見效慢，但由于是多種成分的組合，各成分的作用機(jī)制不同，存在協(xié)同增效作用，往往能取得良好的治療效果，因此，許多專家通過不同的實(shí)驗(yàn)篩選出了降糖活性較好的中藥[12].

多穗柯(LithocarpuspolystachyusRehd.)，別名胖稠、甜味茶等，殼斗科柯屬常綠喬木，藥食同源植物，在我國(guó)主產(chǎn)于江西、廣西及湖南等省，兼具茶、糖、藥3種功能，民間俗稱“甜茶”.其嫩葉具有甜味，屬高甜度、低熱能的天然甜味劑[13].數(shù)百年來，“甜茶”一直被用作治療多種疾病的傳統(tǒng)中草藥[14]，以葉入藥，具有清熱利尿、滋潤(rùn)肝腎、潤(rùn)肺鎮(zhèn)咳等功效，可用于防治溫?zé)崃〖?、皮膚瘙癢、癰疽惡瘡等癥，同時(shí)還具有“三抗”(抗氧化、抗過敏、抗癌變)、“三降”(降血壓、降血糖、降血脂)作用[15-19].在本研究中，筆者采用不同溶劑(二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水)提取法和不同溶劑(乙酸乙酯、正丁醇、水層)萃取法得到多穗柯提取物，并分別測(cè)定提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，篩選出具有最佳抑制效果的活性提取物，以便為后期降糖藥物的研制提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 材料與試劑

材料：多穗柯葉，采集于湖南省邵陽(yáng)市.試劑：石油醚(沸程60～90 ℃)，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，正丁醇，二甲雙胍，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；α-葡萄糖苷酶(G5003-100UN Sigma公司)，對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司)，對(duì)硝基苯酚(PNP，Macklin公司)，阿卡波糖(Acarbose，拜耳公司)，無水碳酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀.所有試劑均為分析純.蒸餾水自制.

1.2 儀器設(shè)備

KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HHSⅡ-2型電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Hidolph Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫集團(tuán))；電子天平ME204E(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHG-9240A立式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；萬(wàn)能粉碎機(jī)(德清拜杰電器有限公司)；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀(美國(guó)美谷分子儀器有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)；索氏提取器.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多穗柯葉的預(yù)處理

多穗柯葉去除雜質(zhì)和枝桿，曬干，用恒溫干燥箱60 ℃干燥4 h，再用粉碎機(jī)粉碎，過50目篩備用.在圓底燒瓶中用石油醚按料液比1∶10(g∶mL)90 ℃回流提取2 h，冷卻抽濾.濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收石油醚，殘?jiān)稍锓Q重，得預(yù)處理樣品用于活性成分的提取.

2.2 多穗柯提取物的制備

取多穗柯預(yù)處理樣品2份各50 g，分別用溶劑提取法和萃取法制備提取物.一份按液料比1∶10 (g∶mL)的配比依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸餾水提取，在80 ℃恒溫水浴鍋中各回流提取2次，每次2 h，趁熱抽濾，合并相同溶劑濾液，濃縮分別得到二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物、蒸餾水提取物.另一份用70%乙醇提取后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，然后依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到乙酸乙酯層、正丁醇層萃取物和水層提取物.

2.3 提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

采用PNPG法進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定[20].將所得的活性物質(zhì)用0.2 mol/L PBS(pH值6.8)溶解，置于4 ℃冰箱中備用.活性檢測(cè)在96孔板上進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)組加25 μL樣品液和25 μL α-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)，對(duì)照組用等體積的PBS代替樣品液，背景組用等體積的PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液，空白組加50 μL PBS.在37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)15 min后，每孔加50 μL PNPG底物(2 mmol/L)，再在37 ℃恒溫箱下培養(yǎng)20 min，每孔加100 μL 濃度為0.2 mol/L 的Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，在酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)OD值(A)，抑制活性用半抑制濃度IC50表示.抑制率I按如下公式計(jì)算：

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

測(cè)定不同質(zhì)量濃度提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，以提取物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)制作抑制率曲線.以阿卡波糖(Acarbose)為陽(yáng)性對(duì)照，如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，抑制活性與質(zhì)量濃度呈正比例關(guān)系，但隨著質(zhì)量濃度超過一定范圍，抑制率變化較小并趨于穩(wěn)定.阿卡波糖(Acarbose)對(duì)照組IC50為25.26 mg/L，甲醇(MeOH)提取物IC50為34.30 mg/L，與陽(yáng)性對(duì)照組最為相近，抑制效果較好，適于獲取抑制活性物質(zhì).二氯甲烷(DCM)提取物抑制效果最差.

圖1 不同極性提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig. 1 Inhibition Rate Curve of Different Polar Extracts Against α-Glucosidase

3.2 不同萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

將70%乙醇溶液提取得到的總活性成分依次采用不同極性溶劑進(jìn)行萃取，分離活性部位，然后以阿卡波糖(Acarbose)為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定不同質(zhì)量濃度萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，正丁醇(NBA)萃取物、乙酸乙酯(ETAC)萃取物、水層(Water)都有不同程度的抑制活性，其中正丁醇(NBA)萃取物IC50為30.47 mg/L，抑制效果最接近阿卡波糖(Acarbose)的IC50，適于獲取用以抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì).

圖2 不同極性萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig. 2 Inhibition Rate Curve of Different Polar Extract Liquor Against α-Glucosidase

4 結(jié)論

使用不同的方法制備了多穗柯提取物(萃取物)，并比較了提取物(萃取物)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)高極性溶劑提取物(萃取物)的抑制活性較好，說明高極性溶劑提取物(萃取物)是α-葡萄糖苷酶的抑制活性部位.筆者初步篩選出抑制α-葡萄糖苷酶的多穗柯活性成分，甲醇提取物(IC50=34.30 mg/L)和正丁醇萃取物(IC50=30.47 mg/L)抑制效果更接近于阿卡波糖(IC50=25.26 mg/L)，為進(jìn)一步研究多穗柯提取物(萃取物)的降糖活性及其機(jī)制奠定基礎(chǔ).