基于熒光碳點(diǎn)建立乳制品中四環(huán)素的快速檢測(cè)方法

文/何智燕 王蓓蓓

（揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院）

乳制品安全是關(guān)乎健康的重大民生問(wèn)題。四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)殖業(yè)中常用的獸藥和飼料添加劑，具有抑菌范圍廣、殺菌能力強(qiáng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，作為牛奶中常用的添加抗生素，其殘留問(wèn)題受到人們的日益關(guān)注。長(zhǎng)期食用含有四環(huán)素類抗生素的乳制品容易造成肝和腎臟的損傷，引發(fā)過(guò)敏和中毒反應(yīng)，還會(huì)使牙齒變黃，嚴(yán)重影響人類的身體健康[1，2]。檢測(cè)四環(huán)素有很多種方法，但是大多數(shù)都比較繁瑣，其中ELISA可以對(duì)樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，但需要多次洗滌、加液、顯色等操作步驟；而膠體金免疫層析法檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到50～100 μg/L[3]。

碳點(diǎn)是一種新型的碳基零維材料，具有優(yōu)秀的光學(xué)性質(zhì)、良好的水溶性、低毒性、環(huán)境友好、原料來(lái)源廣、成本低、生物相容性好等諸多優(yōu)點(diǎn)。碳點(diǎn)大多具有sp2雜化碳的骨架結(jié)構(gòu)，其表面帶有大量碳的含氧基團(tuán)[4～7]（如羥基、羧基等），表現(xiàn)出優(yōu)良的熒光性能，如耐光漂、非閃爍、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、上轉(zhuǎn)換性能等。因此，可以和其他碳納米材料（碳納米管、石墨烯、富勒烯、納米金剛石等）在材料科學(xué)、生物化學(xué)、電子器件以及生物醫(yī)學(xué)等方面發(fā)揮同等重要的作用[8～10]。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本文以L-型半胱氨酸、五氧化二磷和水反應(yīng)合成熒光碳點(diǎn)（CDs），經(jīng)離心獲得碳點(diǎn)溶液，以其作為熒光探針進(jìn)行一定濃度的稀釋，在pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖溶液中，以檢測(cè)對(duì)象四環(huán)素對(duì)其有猝滅現(xiàn)象為機(jī)理，建立一種快捷、靈敏檢測(cè)微量四環(huán)素含量的熒光分析法。該試驗(yàn)對(duì)四環(huán)素含量的測(cè)定方法，已初步應(yīng)用在實(shí)際牛奶樣品的檢測(cè)中，且該方法具有操作簡(jiǎn)單、選擇性高、試驗(yàn)成本低、靈敏應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

1 材料與設(shè)備

1.1 主要材料與試劑

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（Tris-HCl）；四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；熒光分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 碳點(diǎn)的制備

分別稱取0.04 g L-半胱氨酸和2.50 g五氧化二磷置于潔凈的燒杯中，混合均勻，量取2.0 mL純水一次性加入該燒杯中，產(chǎn)生劇烈反應(yīng)，爆出大量白煙后得到棕黃色、略有黑點(diǎn)的透明溶液，將其轉(zhuǎn)移置于離心機(jī)中離心（5 000 r/min，5 min），取上清液，放置一段時(shí)間，多次重復(fù)上述離心的上清液所得的碳點(diǎn)置于4 ℃冰箱中保存，用于進(jìn)一步的鑒定和使用。

2.2 碳點(diǎn)的表征

在常溫條件下，取碳點(diǎn)原液置于比色皿中，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中測(cè)定其紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。在測(cè)碳點(diǎn)溶液熒光光譜時(shí)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，掃描電壓為900 V，掃描速度為1 000 nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm。在上述條件下，改變激發(fā)波長(zhǎng)（310～390 nm），測(cè)定不同激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)碳點(diǎn)的熒光光譜。

2.3 四環(huán)素猝滅熒光碳點(diǎn)的反應(yīng)機(jī)理探討

2.3.1四環(huán)素對(duì)熒光碳點(diǎn)的初步測(cè)量

在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點(diǎn)溶液和1.0×10-4mol/L的四環(huán)素溶液，以不添加四環(huán)素的碳點(diǎn)溶液為空白對(duì)照，于熒光分光計(jì)中檢測(cè)，觀察添加四環(huán)素碳點(diǎn)溶液的熒光變化。

取等量的碳點(diǎn)溶液，分別加入不同濃度的四環(huán)素溶液，置于紫外燈下觀察不同濃度的四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅情況。

2.3.2不同濃度的四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅情況檢測(cè)

在pH值7.4的PBS中，加入一定濃度的碳點(diǎn)溶液，再加入不同濃度的四環(huán)素溶液，經(jīng)反應(yīng)一定時(shí)間后，檢測(cè)碳點(diǎn)的熒光猝滅情況。以不加四環(huán)素的碳點(diǎn)溶液為對(duì)照組。

2.4檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.4.1體系中pH值的優(yōu)化

為確定體系的最佳反應(yīng)pH值，在最佳的碳點(diǎn)使用濃度和反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行pH值的優(yōu)化，即在pH值6.6、7.0、7.2、7.4、8.0下，分別檢測(cè)體系熒光變化量。

2.4.2反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

為確定該體系的最佳反應(yīng)時(shí)間，在最佳的碳點(diǎn)使用濃度和pH值下，配制5組體系，前4組每隔5min檢測(cè)1組體系，后1組每隔15min檢測(cè)1次，最終測(cè)得5組的熒光改變量。

2.4.3反應(yīng)溫度的優(yōu)化

為確定體系的最佳反應(yīng)溫度，在最佳的碳點(diǎn)使用濃度、pH值和反應(yīng)時(shí)間下，配制 5 組體系，每組體系的溫度分別設(shè)為0 ℃、5 ℃、15 ℃、25 ℃、50 ℃，分別檢測(cè)各組熒光改變量。

3 結(jié)果與分析

3.1 碳點(diǎn)的光譜表征

如圖1可見(jiàn)，該碳量子點(diǎn)在紫外光區(qū)300～500 nm有很強(qiáng)的吸收，在此波段內(nèi)隨波長(zhǎng)的增加而吸收強(qiáng)度逐漸減弱。

圖2可觀察到該方法制得的碳點(diǎn)具有很高的熒光性，且最高熒光強(qiáng)度已經(jīng)超越了儀器的量程，因此可以適當(dāng)稀釋碳點(diǎn)濃度，以方便試驗(yàn)的進(jìn)行。

圖3為不同激發(fā)波長(zhǎng)下碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰。由圖可見(jiàn)，碳點(diǎn)在不同的激發(fā)波長(zhǎng)下均有熒光發(fā)射峰。隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大，熒光強(qiáng)度先增大后減小，熒光峰位置不變，說(shuō)明該方法合成的熒光碳點(diǎn)的熒光峰的位置不受激發(fā)波長(zhǎng)影響。以380 nm為激發(fā)所得出的熒光峰值最高，確定后續(xù)試驗(yàn)選擇380 nm為碳點(diǎn)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)。

3.2 四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅作用

圖4為380 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，碳點(diǎn)溶液（a）以及添加四環(huán)素的碳點(diǎn)溶液（b）的熒光發(fā)射光譜圖。從圖中很明顯看出，加入四環(huán)素的碳點(diǎn)溶液熒光峰有很明顯的下降，說(shuō)明四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)有明顯的猝滅作用。

圖1 碳點(diǎn)的紫外吸收光譜

圖2 碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜

3.3 四環(huán)素猝滅碳點(diǎn)熒光的反應(yīng)機(jī)理的探討

本試驗(yàn)探討了四環(huán)素濃度對(duì)碳點(diǎn)猝滅的規(guī)律性。圖5為在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點(diǎn)溶液，再分別加入不同濃度的四環(huán)素，以得到碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜變化圖。

圖3 不同激發(fā)波長(zhǎng)下碳點(diǎn)的熒光值變化趨勢(shì)

圖4 380 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，碳點(diǎn)溶液（a）以及添加四環(huán)素的碳點(diǎn)溶液（b）的熒光發(fā)射光譜圖。

從圖5可知，隨著四環(huán)素的濃度不斷增加，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸下降，但是其熒光峰值的波長(zhǎng)仍然在435 nm左右。結(jié)果說(shuō)明，加入四環(huán)素后體系發(fā)生變化，導(dǎo)致碳點(diǎn)的熒光猝滅。分析原因可能是由于四環(huán)素可以和熒光碳點(diǎn)表面的羥基和羧基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[11]，從而產(chǎn)生非特異性相互作用，對(duì)碳點(diǎn)的熒光產(chǎn)生猝滅所致[12]。而且這種下降的梯度具有規(guī)律性，線性關(guān)系趨勢(shì)很明顯，由此可以構(gòu)建一種以熒光碳點(diǎn)的猝滅機(jī)理來(lái)檢測(cè)四環(huán)素含量的方法。

3.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

3.4.1 體系中pH值的優(yōu)化

針對(duì)四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)猝滅的反應(yīng)pH值進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)pH值在7.4時(shí)，四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的猝滅已經(jīng)達(dá)到最大，再繼續(xù)反應(yīng)，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩(wěn)定，故本試驗(yàn)將反應(yīng)pH值確定為7.4（圖6）。

3.4.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光改變量?F的影響

針對(duì)四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)猝滅的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間在5 min時(shí)，四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的猝滅已經(jīng)達(dá)到最大，再繼續(xù)反應(yīng)，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩(wěn)定，故在本試驗(yàn)后的反應(yīng)時(shí)間確定為5 min（圖7）。

3.4.3 反應(yīng)溫度對(duì)體系熒光改變量?F的影響

針對(duì)四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)猝滅的反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度在25℃時(shí)，四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的猝滅已經(jīng)達(dá)到最大，其它溫度下也有改變，但均小于此溫度下的熒光變化量，故在本試驗(yàn)的反應(yīng)溫度確定為25℃（圖8）。

3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在上述各種優(yōu)化條件下進(jìn)行檢測(cè)，考察碳點(diǎn)在檢測(cè)四環(huán)素的線性范圍以及最低檢出限，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖9所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)四環(huán)素濃度在1.0×10-2～1.0×10-7mol/L范圍增加時(shí)，檢測(cè)體系的整體熒光強(qiáng)度隨之呈規(guī)律性的下降趨勢(shì)。以四環(huán)素濃度以10為底的對(duì)數(shù)值為 X，以碳點(diǎn)的熒光變化量ΔF為Y，建立線性回歸方程Y=106.09X+835.51，線性相關(guān)系數(shù)為0.9728。以不添加四環(huán)素的碳點(diǎn)體系溶液作為空白溶液，平行測(cè)定10 次，以3倍信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以轉(zhuǎn)換后的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，最終得到的檢出限為4.3×10-7mol/L。

圖5 不同濃度的四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅作用

圖6 pH值對(duì)體系熒光猝滅的影響

圖7反應(yīng)時(shí)間對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅的影響

3.6 實(shí)際樣品中四環(huán)素含量的測(cè)量

本試驗(yàn)以伊利純牛奶樣品作為研究測(cè)定對(duì)象，經(jīng)過(guò)脫脂、稀釋等前處理后得到10-1和10-22個(gè)稀釋度，在稀釋的體系中加標(biāo)樣品檢測(cè)其熒光猝滅，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)方差、回收率。結(jié)果得出表1，其標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.0125和0.035，回收率為123%和120%，回收率較高原因可能是所檢測(cè)樣品中本來(lái)就含有微量的四環(huán)素。

4 討論

乳制品中四環(huán)素類藥品殘留的快速檢測(cè)方法有很多種，本試驗(yàn)建立的熒光分析方法具有較高的靈敏度和選擇性，且合成碳點(diǎn)的方法簡(jiǎn)單、方便、快捷，熒光性良好且穩(wěn)定。在進(jìn)行正式試驗(yàn)前，通過(guò)大量預(yù)試驗(yàn)的比較分析，得出時(shí)間、pH值、溫度這3 個(gè)因素對(duì)熒光猝滅的影響比較大。因此，本試驗(yàn)選定這3 個(gè)因素，分別進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，然后在優(yōu)化條件下得出良好的線性方程Y=106.09X+835.51，較高的相關(guān)系數(shù) 0.9728，較寬的檢測(cè)線性范圍級(jí)檢出限4.3×10-7mol/L，測(cè)定不同濃度的四環(huán)素對(duì)碳點(diǎn)熒光猝滅的影響。本試驗(yàn)檢測(cè)牛奶樣品測(cè)得的回收率超過(guò)100%，可能是所測(cè)樣品本身含有微量的四環(huán)素存在。本方法實(shí)現(xiàn)其定性檢測(cè)的高效性和定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，寄希望在深入開(kāi)展乳制品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)中提供一條新的技術(shù)路線

表1 實(shí)際樣品的檢測(cè)

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)碳點(diǎn)的熒光猝滅的影響

圖9 熒光強(qiáng)度變化量與四環(huán)素濃度之間的線性關(guān)系