富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中總磷脂的含量測(cè)定方法研究

文/胡淑紅 王榮艷

（杭州立高檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)研究院有限公司）

乳脂肪球膜（MFGM）含有豐富的磷脂。磷脂，是含有磷脂根的類脂化合物，是生命基礎(chǔ)物質(zhì)，屬于復(fù)合脂，也稱磷脂類、磷脂質(zhì)，為兩性分子，一端為親水的含氮或磷的頭，另一端為疏水（親油）的長(zhǎng)烴基鏈。磷脂對(duì)活化細(xì)胞，維持新陳代謝，基礎(chǔ)代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強(qiáng)人體的免疫力和再生力，都能發(fā)揮重大的作用。 另外，磷脂還具有促進(jìn)脂肪代謝，防止脂肪肝，降低血清膽固醇、改善血液循環(huán)、預(yù)防心血管疾病的作用。不僅如此，磷脂還對(duì)嬰幼兒神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育有積極作用，能提高嬰幼兒的認(rèn)知和發(fā)展，并降低很多感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉的磷脂含量測(cè)定顯得十分重要。

目前尚未有對(duì)乳及乳制品中總磷脂測(cè)定的方法，其他基質(zhì)中磷脂含量的測(cè)定主要有重量法、紫外分光光度法（UV法），傅立葉紅外光譜法（FTIR法）等[1]。

本試驗(yàn)采用鉬藍(lán)法對(duì)富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中的總磷脂（簡(jiǎn)稱“試樣”）含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其方法的穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行研究。

1 儀器和設(shè)備

分光光度計(jì)（配1 cm比色皿）、離心機(jī)（5 000 r/min）、超聲波清洗器、分析天平（感量0.1 mg）、馬弗爐（溫度可控制在550～600 ℃）、封閉式電爐（可調(diào)溫）、瓷坩堝（50 mL）、G3玻璃砂芯坩堝。

2 試劑和材料

本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的三級(jí)水。

2.1 磷酸二氫鉀：使用前在（105±2） ℃下干燥2 h。

2.2 三氯甲烷-甲醇溶液（體積比2:1）：將2 倍體積的三氯甲烷和1倍體積的甲醇溶液混合。

2.3 2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液：量取1 4 0 m L濃硫酸注入3 0 0 m L水中，冷卻至室溫，加入12.5 g鉬酸鈉，溶解并加水稀釋至500 mL，搖勻，靜置24 h備用。

2.4 0.015%硫酸聯(lián)氨溶液：將0.15 g硫酸聯(lián)氨溶解并定容至1 L。

2.5 50%氫氧化鈉溶液：將50 g氫氧化鈉溶解在50 mL水中。

2.6 鹽酸溶液（體積比1:1）：將鹽酸溶解與等體積水中。

2.7 抗壞血酸鈉溶液（25 g/L）：稱取2.5 g抗壞血酸鈉溶解并稀釋至100 mL，該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.8 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取干燥的磷酸二氫鉀0.2197 g，用水溶解并稀釋定容至1 L，此溶液含磷0.05 mg/mL。

3 試驗(yàn)方法

3.1 樣品提取

稱取試樣1.5 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加30 mL三氯甲烷-甲醇溶液，渦旋混合均勻，超聲30 min，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，經(jīng)G3砂芯坩堝過(guò)濾，用10 mL三氯甲烷-甲醇溶液分兩次沖洗砂芯坩堝，濾液合并于坩堝中，將坩堝置于60～80 ℃水浴中蒸干，得到的提取物用于后續(xù)的分析測(cè)定。

3.2 試液制備

在3.1中得到的提取物中加入氧化鋅0.5 g，先在電爐上加熱至近干，逐漸加熱至全部炭化，將坩堝置于550～600 ℃馬弗爐中灼燒至完全灰化，約2 h。取出坩堝冷卻至室溫，加入10 mL鹽酸溶液溶解灰分并加熱至微沸，5 min后停止加熱，待溶解液溫度降至室溫，將溶解液過(guò)濾至100 mL容量瓶中，每次用大約5 mL熱水沖洗坩堝和過(guò)濾器3～4次，將濾液冷卻至室溫后，用氫氧化鉀溶液中和至出現(xiàn)渾濁，緩慢滴加鹽酸溶液至氧化鋅沉淀全部溶解，再滴加2 滴鹽酸溶液，最后用水稀釋定容至刻度，混勻待測(cè)。

3.3 空白試驗(yàn)

除不加樣品提取物外其余都按3.1和3.2操作。

3.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6 支50 mL比色管，按順序加入標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，再依次加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL水，再在6 支比色管中加入硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，鉬酸鈉溶液2 mL，抗壞血酸鈉溶液2 mL，加塞，振搖3～4 次，去塞，沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10 min，移取溶液至潔凈干燥比色皿中，在650 nm處以試劑空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)分別測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，含磷量（0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.5 比色

移取待測(cè)液4 mL于50 mL比色管中，加水6 mL，加入硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，鉬酸鈉溶液2 mL，抗壞血酸鈉溶液2 mL，加塞，振搖3～4 次，去塞，沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10 min，移取溶液至潔凈干燥比色皿中，在650 nm處以試樣空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)測(cè)定吸光值。

3.6 計(jì)算

試樣溶液中各組分含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得，試樣中總磷脂的含量計(jì)算公式如下：

式中：

X——樣品中總磷脂含量，單位為mg/g；

c——標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的被測(cè)物的含磷量，單位為mg；

m——試樣的質(zhì)量，單位為g；

V1——樣品灰化后的定容體積，單位為mL；

V2——比色時(shí)所取的待測(cè)液體積，單位為mL；

26.31——每毫克磷相當(dāng)于總磷脂的毫克數(shù)。

當(dāng)被測(cè)液的吸光度大于0.8時(shí)，需適當(dāng)減少吸取被測(cè)液的體積以保證吸光度在0.8以下。

4 結(jié)果與討論

4.1 線性考察

如表1和圖1所示。

4.2 方法精密度試驗(yàn)

4.2.1 日內(nèi)精密度

對(duì)1 份試樣檢測(cè)試驗(yàn)，做6 個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表2所示。

4.2.2 日間精密度

對(duì)1 份試樣試驗(yàn)，每天做4 個(gè)平行試驗(yàn)，做3 天試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表3所示。

4.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

同一試樣作為本底，本底含量為62.96 mg/g，分別進(jìn)行3 組不同濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，每組做3 個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率，如表4所示。

表1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試數(shù)據(jù)

表2方法日內(nèi)精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

表3方法日間精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

表4磷脂試樣加標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)

4.4 方法穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密量取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL濃度為0.05 mg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 m L比色管中，依次加入1 0.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL純水，其余步驟同3.4操作顯色，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h在650 nm處以試劑空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)測(cè)定吸光值。如表5所示。

4.5 樣品的測(cè)定

分別對(duì)3 個(gè)批次富含乳球膜蛋白乳清粉進(jìn)行總磷脂的含量測(cè)定，結(jié)果如表6所示。

4.6 討論

從圖1看出，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距值較小，R2=0.999，標(biāo)曲的線性良好，而且是隨著磷標(biāo)準(zhǔn)液的濃度增大，鉬藍(lán)吸光度值也增大。由此可得該試驗(yàn)方法的鉬藍(lán)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)液濃度成正比。由表2，表3可得，RSD值均在3%以下，本試驗(yàn)方法的日內(nèi)精密度和日間精密度均為良好。由表4可得，通過(guò)不同的加標(biāo)量所得的回收率均在8 0%～1 0 5%的范圍內(nèi)，回收率的平均值均在90%以上，而且R S D值均在3%以下，試驗(yàn)值均比較穩(wěn)定。由表5得，該方法鉬藍(lán)顯色在4h內(nèi)穩(wěn)定。由表2，表3的精密度，表4的準(zhǔn)確度和表5的穩(wěn)定性可得，總磷脂提取較為完全，而且穩(wěn)定，試驗(yàn)誤差小，準(zhǔn)確率高。由表6可得，不同批次的富含乳球膜蛋白乳清粉的總磷脂測(cè)定含量RSD均在3%以下，故試驗(yàn)測(cè)定值比較穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性測(cè)試數(shù)據(jù)

表6 富含乳球膜蛋白乳清粉中總磷脂的含量

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為以富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉為原料的乳制品中總磷脂的測(cè)定提供依據(jù)。