乳制品抗生素快檢試紙條的研究進展

文/董 菡 張倩瑤 成玉梁 于 航 謝云飛 姚衛(wèi)蓉 郭亞輝＊ 錢 和

（1江南大學食品學院；2浙江省杭州市桐廬縣檢驗檢測中心）

乳中幾乎含有人體所需要的全部營養(yǎng)素和大量具有保健功能的生物活性物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富。隨著乳和乳制品種類的日益增多，其在國民飲食中的地位不斷提高，目前中國已成為全球最大的乳制品新興市場[1]。但乳和乳制品的質(zhì)量問題也隨之成為公眾焦點。其中，抗生素作為乳牛防病、治病的通用藥劑被廣泛用于動物藥品和飼料添加劑中?？股貙θ梭w健康存在潛在的威脅，抗生素的不規(guī)范應用一方面會導致乳制品發(fā)酵異常，使產(chǎn)品理化性質(zhì)發(fā)生改變，影響后期風味形成[2]；另一方面，會增加致病菌耐藥性，提高食用者的疾病治療成本，且過量抗生素會破壞人體正常菌群間的相互制約機制，擾亂機體內(nèi)環(huán)境平衡[3]。

畜牧業(yè)乳產(chǎn)中常用的抗生素主要有青霉素類、四環(huán)素類、β -內(nèi)酰胺類、鏈霉素類等。近年來，我國乳制品抗生素殘留現(xiàn)象時有發(fā)生。2013年對江蘇省蘇州市生乳和零售牛乳制品中β -內(nèi)酰胺酶進行檢測，其中牛乳制品中檢出率為3.2%，生乳中檢出率為41.7%[4]；2013年對鎮(zhèn)江地區(qū)市售純牛奶和奶源戶生鮮牛奶中抗生素殘留情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示抗生素殘留陽性率為5.86%，其中市售包裝純牛奶陽性率4.67%，袋裝純牛奶陽性率4.41%，盒裝純牛奶陽性率4.79%[5]。其他城市的相關(guān)檢測結(jié)果也不容樂觀，由此可見乳制品抗生素殘留現(xiàn)象仍然存在，值得引起高度重視。

根據(jù)《GB/T 4789.27—2008食品衛(wèi)生微生物學檢驗鮮乳中抗生素殘留檢驗》，我國鮮乳中抗生素殘留檢測使用的方法主要是嗜熱鏈球菌抑制法（TTC法）和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法（戴爾沃檢測法），兩者皆為微生物測定法。此外，還有理化檢測法，如高效液相色譜檢測法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等[6]。此類方法普遍建立在儀器分析的基礎(chǔ)上，因其鑒定靈敏度和準確度較高，被廣泛應用于乳制品的抗生素殘留檢測試驗，但同時也存在檢測程序較復雜、費用較高、人力物力消耗大等缺陷。而試紙法具有操作簡單、體積輕小、反應快速、顯示直觀等特點，比較適合小型實驗室或者現(xiàn)場操作。

試紙法是通過經(jīng)特殊制備的試紙與待測成分進行反應所顯示的變化來對待測成分進行目視或儀器定性的一種快速檢測方法[7]。目前應用在乳品抗生素檢測中的試紙條主要有膠體金免疫層析試紙條、酶聯(lián)免疫試紙條、熒光免疫層析試紙條、核酸適配體試紙條和生物膜干涉試紙條?？鞕z試紙條的突出優(yōu)點是操作簡單、反應迅速、攜帶便捷、成本低廉、顯示直觀，可滿足監(jiān)管部門對乳品進行現(xiàn)場初篩檢測的需求，有望成為乳制品中殘留抗生素檢驗的簡易分析工具。

1 免疫分析試紙條

免疫分析技術(shù)基于免疫學原理，利用抗原抗體的免疫學動態(tài)反應過程來完成檢測[8]，目前被廣泛應用于制作抗生素快檢試紙條。因其具有特異性強、靈敏度高、價格低廉、適用于大批量樣本檢測等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為快速檢測方法研究和應用的熱點。根據(jù)所用標記物的不同，此技術(shù)涉及的乳制品抗生素快檢試紙條主要可分為3類，即膠體金免疫層析試紙條（Colloidal gold immunochromatographic test strip，CGICAs）、熒光免疫層析試紙條（Fluorescence immunochromatographic test strip，F(xiàn)IAs）和酶聯(lián)免疫試紙條（ELISA test strip，ELISAs）。

1.1 膠體金免疫層析試紙條

膠體金免疫層析試紙條（CGICAs）基于抗原抗體特異性結(jié)合反應以及固相標記技術(shù)，利用膠體金作為固相標記物，大孔徑微孔濾膜作為載體，以夾心法或競爭法為主要方法定性檢測樣本中抗生素的存在[9]。目前市場上的快檢試紙條多為膠體金免疫快檢試紙條，其可滿足同時檢測多種抗生素的需求，反應快速，肉眼即可辨別現(xiàn)象，但相較于其他免疫層析試紙條，膠體金試紙條的靈敏度稍低。

圖1 基于八重側(cè)流免疫測定法檢測各抗生素的原理圖[12]

李海龍等[10]利用此類試紙條對牛奶中的磺胺類藥物殘留進行檢測，結(jié)果顯示，其對其他抗生素無交叉反應，且與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）相比，檢測結(jié)果符合度可達100%。美國3M公司[11]推出的基于膠體金免疫層析技術(shù)的抗生素檢測試劑條，可準確、快速、便捷地檢測乳品中β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、磺胺和喹諾酮類4 種抗生素藥物的殘留，試驗證明其靈敏度和特異性均高于95%。

Han等[12]提出了針對牛奶中四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺、磺酰胺、氯霉素、鏈霉素等抗生素的免疫層析試紙條，此外還可用于黃曲霉毒素M1和三聚氰胺的檢測，檢測時間小于20 min。這項產(chǎn)品創(chuàng)新性地提出了八重側(cè)流免疫測定法（圖1），制備特異性單克隆抗體和受體，將其結(jié)合到金納米顆粒上，形成的8 種抗體金納米顆粒綴合物作為檢測探針；并合成8 種相應的半抗原-蛋白結(jié)合物，將其固定在硝酸纖維素膜的不同測試區(qū)域上，作為捕獲抗原。此八倍體免疫反應可以同時發(fā)生在單個條帶上，故可用肉眼目測進行定性分析。而對于半定量分析，可以使用智能手機的內(nèi)置攝像頭拍攝測試線，并用Image J軟件分析強度。試驗顯示，所有化學物質(zhì)的檢出限均遠低于當局設定的監(jiān)管限度。此項研究開發(fā)的快速篩選牛奶中常見抗生素的免疫測定法非常有前景。

1.2 酶聯(lián)免疫試紙條

酶聯(lián)免疫試紙條（ELISAs）基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），將待測抗生素的抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，待檢樣品會與酶標抗體和固相載體表面的抗體或抗原反應，加入酶反應底物顯色后，通過顏色深淺可以進行定性或定量分析（圖2）。酶強大的催化效率可顯著放大反應效果，使酶聯(lián)免疫試紙條的檢測達到很高的敏感度[13，14]。但酶標試紙不能同時檢測多種成分，且對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應，可與GC、HPLC等檢測手段聯(lián)合使用，增強其鑒定準確性。

隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，酶聯(lián)免疫試紙條也增加了更多技術(shù)思路。姜侃等[15]應用酶聯(lián)免疫競爭層析技術(shù)設計的檢測乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留試紙條，在使用方便性、檢測靈敏度、精密度以及交叉反應數(shù)據(jù)方面具有顯著優(yōu)勢。Nuryono等[16]設計了采用ELISA法對印度尼西亞牛奶中黃曲霉毒M1殘留的檢測方法，檢測限達5 ng/mL，可用于現(xiàn)場進行大量篩選。

1.3 熒光免疫層析試紙條

熒光免疫層析試紙條（FIAs）是一項新興的免疫檢測試紙條，結(jié)合了免疫反應和色譜層析原理，既保留了膠體金免疫層析試紙條檢測快速、操作簡便的優(yōu)點，又增加了熒光免疫技術(shù)的高靈敏度，近年來被廣泛應用于食品安全的現(xiàn)場篩查。量子點（QDs）是由 II～VI 族或 III～V 族元素組成的新型熒光納米材料，是目前常用的新型熒光標記物，被聚合物材料包裹后形成量子點熒光微球（QBs），再結(jié)合待測抗生素的單克隆抗體制成熒光檢測探針，由此設計的試紙條熒光強度高、穩(wěn)定性強，可快速、直觀地篩查殘留抗生素，極具推廣和應用價值[17，18]。

圖2 ELISA雙抗體夾心法圖示

圖3 CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA條的制備及檢測原理圖[20]

丁喬琪等[19]以羧基化CdTe /ZnSe量子點熒光微球為標記物，通過EDC/NHS活化法將氯霉素（CAP）單克隆抗體與量子點熒光微球偶聯(lián)制備成熒光探針，組裝成新型氯霉素量子點熒光微球免疫層析試紙條。該試紙條可在15 min內(nèi)完成牛奶樣品中CAP的定量檢測，線性范圍為0.1～100.0μg /L，檢出限為0.1 μg /L。

如圖3所示，Li等[20]建立了3 種側(cè)向免疫層析分析（LFIA）方法，以檢測牛奶中的泰樂菌素殘留。該研究應用了膠體金（CG）、乳膠微球（LM）和時間分辨熒光微球（TrFM）在LFIA中用作抗體標記示蹤劑，用于檢測牛奶和豬肉中的泰樂菌素（TYL）和替米考星（TIM）殘留。CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA3種方法的臨界值分別為8 ng/mL、4 ng/mL和2 ng/mL，結(jié)果顯示，熒光方法靈敏度顯著高于膠體金方法，且可在5～8 min獲得結(jié)果。通過此三類LFIAs和LC-MS / MS方法對40個牛奶樣品進行了分析，結(jié)果顯示，3 種方法之間具有良好的相關(guān)性，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。結(jié)果表明，這3 種測定方法可以提供快速、可靠的檢測結(jié)果，能為現(xiàn)場測定大量樣品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素或其他污染物殘留提供多種技術(shù)支持。

2 核酸適配體試紙條

適配體（Aptamer）是一段DNA或RNA序列，通常通過指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）篩選獲得，可與相應的靶標高親和力、特異性結(jié)合。核酸適配體試紙條（Aptamer-based dipstick assay，ABDs）以核酸適配體作為識別因子，通過適配體與抗生素靶標結(jié)合，并利用膠體金、量子點等標記物質(zhì)呈現(xiàn)的光學變化進行快速檢測。與傳統(tǒng)的抗原抗體免疫反應相比，適配體結(jié)合技術(shù)具有親和力強，篩選過程簡單，靶標范圍廣等優(yōu)點。趙帥等[21]

設計的核酸適配體測流層析試紙條可高水平檢測樣品中的氯霉素（CAP）殘留；孫春燕等[22]基于核酸適配體制作的膠體金層析試紙條，將核酸適配體與膠體金結(jié)合，利用四環(huán)素（TCY）與DNA及核酸適配體競爭結(jié)合能力的強弱，提供了一種更適于TCY現(xiàn)場快檢的方法。

圖4核酸適配體試紙條測定黃曲霉毒素（AFB1）的圖示[23]

如圖4所示，Shim等[23]開發(fā)了檢測黃曲霉毒素（AFB1）的核酸適配體半試紙條。該試紙條采用競爭法，在生物素修飾的適配體、靶標AFB1、Cy-5標記的適配體互補序列探針的混合物溶液中插入試紙條。互補序列探針、靶標AFB1與適配體發(fā)生競爭反應，使生物素標記的適配體與靶標AFB1，生物素標記的適配體與互補序列探針在檢測線處結(jié)合，因檢測線處熒光強度與靶標的含量呈負相關(guān)，故可通過熒光強度確定AFB1含量，其檢測限為0.1 ng/mL，以實現(xiàn)AFB1的半定量檢測。

表1五類快檢試紙條的對比分析

圖5生物膜干涉技術(shù)（BLI）原理圖[24]

3 生物膜干涉試紙條

由生物膜干涉技術(shù)（BLI）為原理設計的生物膜干涉試紙條（Biofilm interference test strip，BIs）是一類新型的、可定性檢測乳品中抗生素殘留的快檢方法。其原理是當光在同質(zhì)光源中傳播時，如果傳播距離有差別就會產(chǎn)生光程差（圖5a），光程差導致光發(fā)生干涉現(xiàn)象，從而使不同波長光線的干涉形成干涉譜（圖5b）[24]。當結(jié)合在生物膜傳感器上的抗生素抗體或適配體與加入的樣品中殘留抗生素結(jié)合時，會使生物膜厚度產(chǎn)生變化，導致其上透過的反射光頻率受到影響（圖5c）[25]。若在其內(nèi)添加熒光標記物，即可根據(jù)顏色變化反映現(xiàn)象。生物膜干涉技術(shù)具有可不借助標記物而實時檢測的特點，尤適合于低親和力或解離快速的抗體的現(xiàn)場快速篩查[26]。

劉小軍等[27]由BLI結(jié)合納米金信號放大技術(shù)，建立了能檢測牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素的快檢試紙條。試驗結(jié)果表明，金標記的BLI較非標記BLI能夠顯著提高檢測的靈敏性，比采用相同原料制備的免疫層析試紙條靈敏度高1倍，能快速、有效地檢測出樣品中抗生素的存在。陳軍[28]以氯霉素半琥珀酸酯為母體，直接偶聯(lián)物固著在傳感器末端形成具有雙層結(jié)構(gòu)的生物膜，通過檢測端面生物膜層的厚度變化所引起的光譜相位改變，實現(xiàn)樣品中氯霉素（CAP）的快速檢測。雖然該試驗表明，采用金標記生物膜干涉試紙條檢測牛乳中抗生素殘留的競爭結(jié)合反應時間需要90 min以上才能達到平臺期，比免疫層析試紙條方法（6 min）的檢測周期要長，但該試紙條檢測氯霉素殘留的靈敏性要明顯高于免疫層析試紙條，故該方法仍是一種簡便、快捷的檢測方法，可以用于牛乳中氯霉素抗生素殘留的快速檢測。

4 小結(jié)

隨著乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，乳品中的抗生素殘留問題已越來越多地受到政府和消費者的重視。本文主要綜述了各類快檢試紙條在乳品中抗生素檢測方面的研究進展（表1），著重介紹了各類抗生素快檢試紙條的原理、優(yōu)點及應用范圍?？鞕z試紙條具有攜帶便捷、操作簡便、反應迅速、現(xiàn)象直觀、經(jīng)濟實用等優(yōu)點，在乳與乳制品殘留抗生素的現(xiàn)場檢測中具有良好前景。加大此類快檢試紙條的研發(fā)與推廣，能有效降低乳制品中抗生素檢測的成本，大大提高乳制品中抗生素檢出的準確率，嚴格限制抗生素的非法添加，為人們的乳飲生活提供保障。