間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)巨噬樣細(xì)胞分化和極化的影響

王國(guó)霖,王麗清,李潔,王謝東,葉進(jìn)培,吳長(zhǎng)新

(山西大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院,山西 太原030006)

0 引言

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞存在于人臍帶血中,具有旺盛自我更新能力以及向多胚層分化的潛能,參與組織修復(fù),包括修復(fù)心肌、胰、腎、肝、肺、支氣管、血管、皮膚、骨等組織或器官的損傷[1-2]。在炎性病癥的研究中,間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞(macrophage,MΦ) 功能已有研究。通過(guò)與MSCs的共培養(yǎng),MΦ的白細(xì)胞介素-10(IL-10),IL-4的表達(dá)增加且減少了促炎細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α (TNF-α),IL-6,IL-12,IL-1β的產(chǎn)生[3];MSCs條件培養(yǎng)基還對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷具有保護(hù)作用[4]。MSC產(chǎn)生的效應(yīng)分子驅(qū)動(dòng)抗炎功能,并且MSCs可以減弱炎癥,在減輕促炎網(wǎng)絡(luò)和放大抗炎信號(hào)中的核心作用[5]。這表明MSCs對(duì)機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)朝向抑炎表型。

MΦ是一群異質(zhì)性免疫細(xì)胞,在機(jī)體進(jìn)行非特異性吞噬殺傷多種病原微生物,是機(jī)體中重要的非特異性免疫防御保障之一,是可塑程度較高的細(xì)胞,容易從一種功能表型轉(zhuǎn)換為另一種功能表型以響應(yīng)新的微環(huán)境信號(hào)[6-7]。為了研究體外巨噬細(xì)胞活化,使用各種刺激來(lái)誘導(dǎo)特定的巨噬細(xì)胞活化表型。通常,MΦ可以通過(guò)γ-干擾素(IFN-γ)和脂多糖(LPS)“經(jīng)典地”激活導(dǎo)致促炎(classically activated ma-crophage, M1)表型和白細(xì)胞介素(IL-4/IL-13),免疫復(fù)合物或糖皮質(zhì)激素,以誘導(dǎo)“替代”活化(alternatively activated macrophage,M2)表型[8-10]。M1和M2間功能分化軸的平衡表明機(jī)體促炎和抑炎兩種免疫功能的相對(duì)形式變化。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor, M-CSF)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞所形成的M2表型,不僅增加CD163水平,也通過(guò)IL-10或IL-4的額外極化進(jìn)一步調(diào)節(jié)[8]。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞表達(dá)上調(diào)CD68、CD80、CD86以及MHCⅡ;IL-6、IL-8、IL-12、IL-23等是促炎性的細(xì)胞因子,它們?cè)贛1中表達(dá)較高[8,11]。

THP-1 (Human acute monocytic leukemia cell line),常用作體外MΦ的生物學(xué)特性和免疫功能研究,這歸功于它的永生增殖特性。因?yàn)樵鷨魏思?xì)胞或單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞沒(méi)有良好增殖和壽命短的特性,因此它們用于體外MΦ模型和功能研究的用途受到限制。另外,THP-1可在PMA或VD3刺激下誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MΦ-like)[12-13]。

在體內(nèi)MSCs及其效應(yīng)因子對(duì)MΦ免疫調(diào)節(jié)均傾向于炎癥的抑制,那么在體外由THP-1分化的MΦ模型中MSCs培養(yǎng)物中的效應(yīng)因子是否也會(huì)使其朝抑炎表型方向發(fā)展?我們的研究通過(guò)將THP-1分化成的MΦ直接暴露于MSCs條件培養(yǎng)基中,經(jīng)FACS以及qRT-PCR分析,以明確MSCs條件培養(yǎng)基中的效應(yīng)物對(duì)體內(nèi)外MΦ免疫分化模型上的一致性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1(人急性白血病單核細(xì)胞)購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供復(fù)蘇。細(xì)胞均在加濕的37℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)10% FBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI+谷氨酰胺中懸浮生長(zhǎng)。按Beeravolu等方法從臍帶與胎盤連接處分離獲得和培養(yǎng)MSCs[14]。第5代原代MSCs在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)20% FBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM：F12中貼壁生長(zhǎng)并每2 d收集一次MSCs培養(yǎng)基上清，用作THP-1培養(yǎng)或分化的補(bǔ)充材料。MSCs培養(yǎng)圖片通過(guò)Zeiss熒光顯微鏡(型號(hào): Axiocam 506 color)觀察(圖1)。

圖1 臍帶與胎盤MSCs分離后培養(yǎng)與鑒定。a.MSCs體外成軟骨、成骨和成脂定向分化染色。茜素紅染色為橙紅色即為成骨細(xì)胞,阿爾辛藍(lán)染色為藍(lán)綠色即為軟骨細(xì)胞,油紅O染色為紅色或粉紅色即為脂肪粒。b.MSCs的表面標(biāo)記分子表達(dá)情況。PE表示MSCs不表達(dá)的表面標(biāo)記,包括:CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR。FITC表示CD90,PerCP-Cy5表示CD105,APC表示CD73Fig.1 Culture and identification of CPJ(cord-placenta junction)-MSCs after isolationa. MSCs were induced to differentiate into cartilage,osteogenesis and adipogenic differentiations in vitro.Alizarin red staining is orange red, which is osteoblast,Alcian blue staining is blue-green,which is chondrocyte,and oil red O is red or pink, which is fat.b. Expression of surface marker molecules of MSCs.PE indicates surface markers not expressed by MSCs,including: CD34, CD11b, CD19, CD45, and HLA-DR.FITC stands for CD90, PerCP-Cy5 stands for CD105, and APC stands for CD73

將THP-1按2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)/孔在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),以RPMI-1640 培養(yǎng)基和DMEM:F12培養(yǎng)基半數(shù)混合培養(yǎng)作為對(duì)照,以RPMI-1640 培養(yǎng)基和MSCs培養(yǎng)物半數(shù)混合培養(yǎng)液, 含10 ng·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基和MSCs培養(yǎng)物半數(shù)混合培養(yǎng)液, 以及含10 ng·mL-1的RPMI-1640 培養(yǎng)基和MSCs培養(yǎng)上清半數(shù)混合培養(yǎng)液(10 ng·mL-1PMA首先刺激THP-1 24 h,之后換掉含PMA的培養(yǎng)基,在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中加入含有經(jīng)半數(shù)稀釋的MSCs培養(yǎng)物培養(yǎng)基,簡(jiǎn)稱pMSC)。每?jī)商煅a(bǔ)充培養(yǎng)基1次。待培養(yǎng)至96 h,加入1 μg·mL-1的LPS 極化細(xì)胞至120 h,收集細(xì)胞做FACS分析。測(cè)定細(xì)胞因子表達(dá):以相同的方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),但在細(xì)胞培養(yǎng)114 h時(shí),各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中加入1 μg·mL-1LPS,LPS刺激6 h后開(kāi)始收集細(xì)胞提取RNA以進(jìn)行細(xì)胞因子實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析。

1.2 相關(guān)試劑

1.3 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞總RNA 使用經(jīng)典Trizol提取法得到RNA后,再用反轉(zhuǎn)錄試劑將mRNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,并稀釋5倍。利用qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23的mRNA相對(duì)表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 MSCs染色

按Fernandes的方法通過(guò)細(xì)胞染色觀察對(duì)MSCs進(jìn)行分化鑒定[15]。成骨分化通過(guò)堿性磷酸酶染液分析;成軟骨分化通過(guò)阿爾辛藍(lán)染色分析;成脂分化通過(guò)堿性磷酸酶染液分析油紅O染色分析(如表2)。

表1 相關(guān)細(xì)胞因子的引物

表2 MSCs分化檢測(cè)試劑

1.5 流式分析

MSCs鑒定:按照Fernandes等[15]的方法通過(guò)FACS分析對(duì)MSCs進(jìn)行鑒定。使用以下標(biāo)記對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色:PE-CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR、 FITC-CD90、PerCP-Cy5-CD105、APC-CD73。通過(guò)FACS Canto(BD Biosciences)和FlowJo軟件(Tree Star,Ashland,OR,USA)分析。

MSCs誘導(dǎo)分化:按照Marc Daigneault等方法通過(guò)FACS分析對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型分型[13]。使用PE-Cy7-Hu CD80,PE-Hu CD86,FITC-Hu MHCII和APC-Hu CD163標(biāo)記對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,與相應(yīng)的同種型對(duì)照。用FACS Canto和FlowJo軟件分析表型。通過(guò)在正向和側(cè)向散射上設(shè)置門,顯示活細(xì)胞的光散射特性的細(xì)胞,從分析中排除細(xì)胞碎片。對(duì)每個(gè)樣品分析最少1×104個(gè)細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)

OriginPro 8.5軟件作圖和SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,不同組數(shù)據(jù)間進(jìn)行ANOVA方差分析,以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臍帶與胎盤MSCs分離后培養(yǎng)與鑒定

MSCs的增殖速度較快,培養(yǎng)后均呈現(xiàn)典型成纖維樣、紡錘形。從圖1a可以看到MSCs分化成軟骨、成骨和成脂。經(jīng)檢測(cè)MSCs細(xì)胞表面陰性標(biāo)志物(0.2%)和3個(gè)陽(yáng)性標(biāo)志物(CD73 99.3%/CD90 95.8%/CD105 98%),且細(xì)胞表面陽(yáng)性標(biāo)記物表達(dá)不低于95%,陰性標(biāo)記物表達(dá)不高于2%(圖1b)。結(jié)果顯示,從臍帶與胎盤連接處的細(xì)胞被分離培養(yǎng)后具有較好的分化能力,可以判定是MSCs。

2.2 MSCs培養(yǎng)分泌物誘導(dǎo)巨噬樣細(xì)胞向M2進(jìn)一步分化

采取CD80/MHCⅡ/CD86 MFI值與CD163 MFI值的大小比較鑒定MΦ分化趨勢(shì)(巨噬細(xì)胞Ⅰ型, M1和巨噬細(xì)胞Ⅱ型,M2)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析了MΦ-like在MSCs培養(yǎng)物誘導(dǎo)細(xì)胞表面標(biāo)志CD80、CD86、MHCⅡ和CD163的表達(dá)情況。

如圖2a-2d所示,THP-1直接經(jīng)LPS作用24 h后,其CD80和CD163表達(dá)均沒(méi)有顯著變化,CD86和MHCⅡ的表達(dá)則輕微升高。而MSC預(yù)處理THP-1 96 h后,其CD80、CD86、MHCⅡ和CD163表達(dá)均未明顯改變,表明MSCs培養(yǎng)物短時(shí)間內(nèi)未能對(duì)THP-1分化有明顯影響。

THP-1在PMA誘導(dǎo)形成MΦ-like后,PMA處理的THP-1的 CD86 MFI為3 993,稍微大于其CD163(3 336), 表明10 ng·mL-1PMA刺激使MΦ-like表現(xiàn)出較輕的M1偏移。MΦ-like被MSCs誘導(dǎo)(pMSC)的細(xì)胞,MSCs培養(yǎng)物極顯著提高CD163的表達(dá),其MFI值13 668, 但其他MΦ表面標(biāo)志表達(dá)較低,其MFI分別是 CD80(-1 870)、CD86(2 698)、MHCⅡ(208),顯示在MSC效應(yīng)分子的作用下,pMSC處理組的細(xì)胞分化趨于M2表型(圖2a, 2b, 2c, 2d)。PMA單獨(dú)處理THP-1后CD86、MHCⅡ和CD163的表達(dá)程度都較高,顯示PMA的刺激作用使人源單核細(xì)胞系THP-1很好地分化為MΦ-like。

a,b,c,d分別顯示的是對(duì)照/MSC/PMA/pMSC處理細(xì)胞的CD80、CD86、MHCⅡ、CD163的MFI(Mean fluorescence intensity,平均熒光強(qiáng)度)值。對(duì)照是DMEM:F12與PRIM-1640半數(shù)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞;“isotype”均為對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組同型抗體對(duì)照;MSC處理組表示MSCs細(xì)胞培養(yǎng)物(培養(yǎng)基上清)與PRIM-1640半數(shù)混合培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞;PMA表示在PMA (10 ng·mL-1)存在下DMEM:F12與PRIM-1640半數(shù)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞;pMSC表示在PMA (10 ng·mL-1)處理24 h后更換MSC細(xì)胞培養(yǎng)物(培養(yǎng)基上清)與PRIM-1640半數(shù)混合培養(yǎng)液。MFI(Mean Fluorescence Intensity)=實(shí)驗(yàn)組平均值-同型組平均值。圖2結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2 MSCs培養(yǎng)物誘導(dǎo)THP-1及巨噬樣細(xì)胞表面標(biāo)志CD80、CD86、MHCⅡ、CD163表達(dá)的FACs分析。a, b, c, and d show the MFI (mean fluorescence intensity) values of CD80, CD86, MHCII, and CD163 in the Control/MSC/PMA/pMSC treated THP-1, respectively. Control is THP-1 cells cultured in DMEM: F12 and PRIM-1640 half mixed medium; "isotype" is the antibody isotype; pMSC represents MΦ-like cells cultured in mix medium of 50% MSCs culture supernatant and 50% PRIM-1640 for 96 h after PMA treatment for 24 h (pMSC).PMA represents THP-1 cells cultured in 50% DMEM:50% F12 and PRIM-1640 mixture medium with 10 ng·mL-1 PMA for 24 h, and then cultured without PMA for 96 h. MFI=experimental group mean value-homotype group mean value. Results in the figures above represent one of three independent experimentsFig.2 FACs analysis of the expression of cellular surface markersof CD80,CD86,MHCⅡ,CD163 on THP-1 and MΦ-like.

2.3 LPS的極化對(duì)MSCs培養(yǎng)基上清誘導(dǎo)的MΦ-like表面標(biāo)志物CD80、CD86、MHCⅡ和CD163的影響

為了研究LPS在MSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)MΦ分化后對(duì)其極化的影響,在96 h加入LPS。在第120 h FACS分析CD80、CD86、MHCⅡ和CD163極化后的變化(圖3)。

與對(duì)照組(Control組)相較,極化后(Control+LPS)MHCⅡ的平均值表達(dá)上調(diào),CD80、CD86、CD163表達(dá)無(wú)變化(圖3a)。在添加LPS的MSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1(MSC+LPS),與未極化(MSC組)相較,CD86、MHCⅡ表達(dá)上調(diào),CD80、CD163表達(dá)無(wú)變化(圖3b)。結(jié)果表明,在無(wú)PMA刺激,LPS的加入只上調(diào)表達(dá)了M1細(xì)胞表面標(biāo)志物MHCⅡ和CD86,而M2細(xì)胞表面標(biāo)志物CD163卻始終沒(méi)有或極弱表達(dá)。另外, 添加LPS的MSCs培養(yǎng)基上清誘導(dǎo)THP-1(MSC+LPS)和LPS極化的對(duì)照組(Control+LPS)兩者間CD80、CD86、MHCⅡ和CD163的表達(dá)差異較小(圖3a和3b),這表明無(wú)PMA刺激時(shí),LPS的極化作用對(duì)單核細(xì)胞的分化在細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上無(wú)影響或極弱影響。 PMA分化THP-1獲得的MΦ-like經(jīng)LPS極化(PMA組)表達(dá)CD80(MFI=17 798),同時(shí)CD86(MFI=5 885)、MHCⅡ(MFI=1 235)的MFI值均高于CD163(MFI=747),指示MΦ-like朝M1分化。LPS下調(diào)CD163表達(dá)使原本在未極化前向M1分化的MΦ更加趨于成熟(圖3c)。MΦ-like被MSCs誘導(dǎo)且于LPS的極化下(pMSC+LPS),CD80(MFI=9 272)和CD86(MFI=3 149)的MFI值上要高于CD163(MFI=2805)(圖3d),這表明MΦ-like經(jīng)MSCs培養(yǎng)物的誘導(dǎo)和LPS的極化使MΦ-like由M2樣向M1型極化方向偏移。CD163在pMSC處理組有明顯的峰圖位移,而LPS的加入抑制了CD163表達(dá)(圖3d)。在LPS極化作用影響下,MSCs培養(yǎng)物誘導(dǎo)MΦ-like具有明顯M1特征(圖3d)。

a. Control和Control+LPS (Control+L)及其各自同型組;b. MSC和MSC+LPS (MSC+L)及其各自同型組;c. PMA和PMA+LPS (PMA+L)及其各自同型組;d. pMSC和pMSC+LPS (pMSC+L)及其各自同型組。圖中值均為MFI值。進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)圖3 MSCs分泌物影響LPS對(duì)MΦ的極化a. Control and Control+LPS (Control+L) and their respective isotypes; b. MSC and MSC+LPS (MSC+L) and their respective isotypes; c. PMA and PMA+LPS (PMA+L) and individual isotypes;d. pMSC and pMSC+LPS (pMSC+L) and their respective isotypes.The values in the figure are all mean values.Results in the figures above represent one of three independent experimentsFig.3 Effect of supernatant of MSCs culture on the polarization of MΦ by LPS

2.4 MSCs培養(yǎng)物對(duì)巨噬樣細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子的影響

MSCs分泌可以使MΦ IL-10的表達(dá)水平提高。pMSC組與PMA分化獲得MΦ-like和未分化THP-1比較,MSCs培養(yǎng)物不僅顯著提升IL-10的mRNA表達(dá)水平,且mRNA表達(dá)量相較對(duì)照組高出93.6倍。MSCs培養(yǎng)物同樣顯著上調(diào)IL-8的mRNA的表達(dá)(圖4a)。LPS極化后,IL-8表達(dá)都較高。pMSC組中,IL-6表達(dá)僅次于IL-8(圖4b)。有趣的是,IL-12則在細(xì)胞中的表達(dá)在LPS極化下提升較小(圖4b)。pMSC組的免疫應(yīng)答反應(yīng)中,炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-8)mRNA表達(dá)上調(diào)。

a. MSCs效應(yīng)物對(duì)巨噬樣細(xì)胞產(chǎn)生IL-10和IL-8的變化;b. MSCs培養(yǎng)物誘導(dǎo)MΦ-like分化響應(yīng)與LPS極化后的免疫應(yīng)答;通過(guò)計(jì)算2(無(wú)LPS處理-LPS處理) 得到數(shù)據(jù)。每個(gè)條形代表一式三份樣品的平均值±SD。NS (No significant difference)表示無(wú)顯著差異,P<0.05顯著性差異圖4 MSCs效應(yīng)物在LPS極化作用下的免疫應(yīng)答a. qRT-PCR analysis of the effect of MSCs supernantant on the expression of IL-10 andIL-8 in macrophage-like cells; b. qRT-PCR analysis of effect of MSCs supernantant on the expression of IL-10 and IL-8 in macrophage-like cells after LPS polarization.Relative expression is obtained by calculation using 2Δno LPS treat-ΔLPS treat. Each bar representsthe mean ± SD of triplicate samples.NS means no significant difference, P<0.05 denotes significantly differentFig.4 Effect of MSCs supernatant on the polarization of MΦ-like by LPS

3 討論

許多研究表明MSCs被作為許多疾病,特別是慢性疾病治療手段,并具有較高的安全性和有效性,主要是因?yàn)镸SCs具有顯著免疫調(diào)節(jié)特性,及其良好的造血支持作用[16]。盡管骨髓是獲得MSCs的最常見(jiàn)來(lái)源,但臍帶血代表了另一種來(lái)源,可以方便地收集,而且沒(méi)有重大的倫理問(wèn)題[17]。MSCs駐留在組織中旁分泌效應(yīng)因子可以局部浸潤(rùn)MΦ以適應(yīng)更多的調(diào)節(jié)特性[18]。MSCs從臍帶與胎盤連接處獲得,經(jīng)過(guò)其分化能力、特染色測(cè)定以及表面標(biāo)志物分析,證實(shí)獲得了狀態(tài)較好并具有典型表型MSCs。

MSCs所分泌的細(xì)胞因子較為豐富,在我們之前的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導(dǎo)單核細(xì)胞及MΦ分化的研究中,GM-CSF可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞以及體外的巨噬樣細(xì)胞朝M1方向分化,而MSCs分泌的GM-CSF含量很高(ELISA測(cè)定稀釋1 000倍后OD值仍超出檢測(cè)范圍),故我們直接將MSCs培養(yǎng)基進(jìn)行半數(shù)稀釋去誘導(dǎo)單核細(xì)胞及巨噬樣細(xì)胞的分化,但結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后沒(méi)有得到GM-CSF預(yù)期誘導(dǎo)的M1 巨噬細(xì)胞,而是向著M2方向發(fā)展(圖2)。由于MSCs培養(yǎng)物中效應(yīng)因子繁雜,未知其誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞用量及效力如何,故在實(shí)驗(yàn)中將MSCs培養(yǎng)物與THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行半量混加的方式進(jìn)行培養(yǎng)。

體內(nèi)MSCs對(duì)炎癥調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)為抑制。在本研究中,MSCs培養(yǎng)物可誘導(dǎo)MΦ-like的抗炎表型,同時(shí)也增加了IL-10的表達(dá)。流式分析發(fā)現(xiàn),LPS對(duì)M1的成熟具較強(qiáng)促進(jìn)作用。MSCs的效應(yīng)物誘導(dǎo)MΦ-like的分化作用也會(huì)在LPS極化后表現(xiàn)出炎性調(diào)節(jié)趨勢(shì),表明LPS的極化作用要強(qiáng)于MSCs的誘導(dǎo)作用,這暗示了分化環(huán)境被病原微生物入侵,MSCs所分泌效應(yīng)物的抑炎免疫調(diào)節(jié)可能受到影響,抗炎作用會(huì)下調(diào)。

據(jù)報(bào)道,早期THP-1具有不同于單核細(xì)胞的基因表達(dá)模式,并且當(dāng)用PMA處理時(shí),在MΦ中誘導(dǎo)的某些基因,例如載脂蛋白-E也在PMA中被誘導(dǎo)，但這是單核衍生的MΦ中相反調(diào)節(jié)的基因[19]。盡管MΦ-like的某些形態(tài)和其他特征與MΦ相似,但從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的角度看,兩者并不相同。這可以解釋LPS對(duì)MSCs培養(yǎng)物誘導(dǎo)的MΦ-like的免疫應(yīng)答中IL-12低變化現(xiàn)象,但是否MSCs培養(yǎng)物中的某一種效應(yīng)因子參與并抑制了LPS極化MΦ-like里IL-12 mRNA的表達(dá)量?這有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,通過(guò)體內(nèi)微環(huán)境分化的MΦ與體外構(gòu)建的MΦ分化模型,盡管二者在轉(zhuǎn)錄水平上存在差異,但MSCs培養(yǎng)物可體外調(diào)節(jié)MΦ免疫功能分化的方向,使MΦ-like分化朝向抑制炎癥的M2發(fā)展,這與體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)研究相符。需要注意的是,在巨噬細(xì)胞功能性研究上,要據(jù)實(shí)驗(yàn)需求慎重選擇巨噬細(xì)胞模型。