高原地區(qū)顱腦損傷患兒血清HIF-1α、miR-210水平與繼發(fā)性癲癇的關系

汪生毅，孫小紅，李海棟，李佩章，王歲英，李玉鵬

高原地區(qū)低壓、低氧環(huán)境嚴重影響心肺、神經系統(tǒng)功能，當出現顱腦損傷后，缺氧所導致的腦病理損傷加重，進一步加重病情，研究發(fā)現高原地區(qū)顱腦損傷發(fā)生率明顯高于平原地區(qū)[1]。顱腦損傷后會引發(fā)一系列并發(fā)癥，繼發(fā)性癲癇(secondary epilepsy，SE)是顱腦損傷的并發(fā)癥之一，病程較長，發(fā)展緩慢，其發(fā)生率為2%～40%，嚴重影響患者生活質量。顱腦損傷后SE的發(fā)生機制較復雜，目前尚無統(tǒng)一定論[2]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下發(fā)揮作用的特異性轉錄因子，研究證實腦組織缺氧后，組織中HIF-1α水平升高對腦組織具有一定的保護作用[3-4]。微小RNA-210(miR-210)主要存在于缺氧細胞及組織中，研究發(fā)現缺血缺氧腦損傷后，腦組織miR-210表達上調，可促進血管再生[5]。然而HIF-1α、miR-210水平與顱腦損傷后SE的關系，目前尚不明確。現對高原地區(qū)顱腦損傷患兒血清HIF-1α、miR-210表達進行檢測，并分析兩者與顱腦損傷后SE的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月—2019年2月青海省婦女兒童醫(yī)院收治高原地區(qū)顱腦損傷患兒236例作為研究對象，根據是否發(fā)生SE分為SE組(52例)與無SE組(184例)。SE組男34例，女18例，年齡5～13(5.65±1.27)歲；格拉斯哥昏迷(GCS)評分(12.07±1.42)分；驚厥發(fā)作次數<6次18例，≥6次34例；損傷原因：擊打傷6例，擠壓傷8例，撞擊傷12例，摔傷21例，其他復合傷5例；損傷類型：開放性損傷31例，閉合性損傷21例；損傷部位：額葉19例，其他部位33例；合并腦挫裂傷35例，顱內血腫21例，顱骨骨折30例，蛛網膜下腔出血23例。無SE組男113例，女71例，年齡4～13(6.02±1.31)歲；GCS評分(13.53±1.24)分；驚厥發(fā)作次數<6次124例，≥6次60例；損傷原因：擊打傷23例，擠壓傷29例，撞擊傷42例，摔傷76例，其他復合傷14例；損傷類型：開放性損傷77例，閉合性損傷107例；損傷部位：額葉75例，其他部位109例；合并腦挫裂傷62例，顱內血腫20例，顱骨骨折25例，蛛網膜下腔出血31例。2組患兒性別、年齡、損傷原因、損傷部位比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而GCS評分[6]、驚厥發(fā)作次數、損傷類型、合并腦挫裂傷、顱內血腫、顱骨骨折、蛛網膜下腔出血比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.915,χ2=18.173、5.156、18.921、24.604、44.124、17.228，P均=0.000)。以HIF-1α表達量中位值1.77和miR-210表達量中位值1.64將患兒分為低表達亞組與高表達亞組。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①年齡≤13歲；②經臨床、影像學等檢查確診為腦損傷；③患兒住院期間臨床資料完整。(2)排除標準：①合并腦炎如麻疹腦炎、化膿性腦膜炎；②中樞神經系統(tǒng)感染；③先天性腦血管畸形或腦發(fā)育異常造成的癲癇；④癲癇家族史；⑤顱腦損傷前有癲癇病史。

1.3 血清HIF-1α、miR-210水平檢測 患兒入院后采集空腹外周靜脈血3 ml， 離心收集上層血清，在-20℃冰箱內保存?zhèn)溆?。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測血清HIF-1α、miR-210水平。采用Trizol試劑(北京百奧萊博科技有限公司)提取血清中總RNA，參照逆轉錄試劑盒(杭州主諾生物技術有限公司)將RNA反轉錄為cDNA，反應體系為20 μl：2倍反應緩沖液2 μl，MgCl24 μl，OligodT引物1 μl，AMV Reverse transcriptas 0.6 μl，RNA抑制劑0.5 μl，RNA 1 μl，滅菌水10.9 μl。反應程序為42℃ 溫育1 h，95℃熱激 5 min，4℃保存10 min，反應結束后，收集cDNA，進行qRT-PCR反應，使用iQ5 Real Time型PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行PCR擴增(PCR擴增試劑盒購自生工生物工程上海股份有限公司)及熔解曲線分析。配制反應體系50 μl：反應緩沖液5 μl，Taq酶0.5 μl，dNTP 4μl，Pmix 2.5 μl，上下游引物分別為1 μl，滅菌水36 μl。擴增條件：94 ℃預變性5 min，隨后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，進行35個循環(huán)。HIF-1α以β-actin作為內參，miR-210以U6作為內參，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物序列見表1。采取2-ΔΔCt算法定量評估HIF-1α、miR-210相對表達量。

表1 HIF-1α、miR-210引物序列

2 結 果

2.1 2組血清HIF-1α、miR-210水平比較 SE組患兒血清HIF-1α、miR-210表達明顯高于無SE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組患兒血清HIF-1α、miR-210水平比較

2.2 SE組患兒血清HIF-1α、miR-210在不同臨床參數中表達比較 SE患兒HIF-1α、miR-210高表達者較低表達者GCS評分降低、驚厥發(fā)作≥6次比例增加(P<0.05)，與損傷類型、合并癥比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同臨床參數SE患兒血清HIF-1α、miR-210表達的比較

2.3 SE患兒HIF-1α、miR-210相關性分析 Pearson相關性分析發(fā)現，SE患兒HIF-1α與miR-210呈正相關(r=0.671，P=0.000)，HIF-1α、miR-210與GCS評分呈負相關(r=-0.571、-0.608，P均=0.000)，與驚厥發(fā)作≥6次均呈正相關(r=0.635、0.691，P均=0.000)。

2.4 影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險因素 將顱腦損傷患兒發(fā)生繼發(fā)性癲癇為因變量，以GCS評分、驚厥發(fā)作次數、損傷類型、合并癥、HIF-1α、miR-210作為自變量進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示GCS評分低、驚厥發(fā)作次數≥6次、合并顱內血腫、合并蛛網膜下腔出血、HIF-1α高表達、miR-210高表達是影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的獨立危險因素，見表4。

表4 Logistic回歸分析影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險因素

2.5 HIF-1α、miR-210在顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇中的預測價值 HIF-1α對顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預測的AUC為0.874(95%CI0.823～0.928)，最佳截斷值為1.48，敏感度為75.67%，特異度為86.75%，約登指數為0.624；miR-210對顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預測的AUC為0.856(95%CI0.804～0.898)，最佳截斷值為1.43，敏感度為73.08%，特異度為88.05%，約登指數為0.611，見圖1。

3 討 論

繼發(fā)性癲癇又稱獲得性癲癇，患者由于神經元異常放電造成中樞神經功能暫時失常，常見的致病原因主要有顱腦損傷、顱內感染、顱內腫瘤等[7]。SE發(fā)生機制較復雜，目前尚未完全明確。顱腦損傷后可導致腦出血、腦挫裂傷，進而引發(fā)腦部缺血缺氧，使大腦神經元異常放電從而引發(fā)癲癇，因此顱腦損傷程度嚴重者發(fā)生繼發(fā)性癲癇的風險較高。本研究發(fā)現，SE組患兒GCS評分低于無SE組，GCS評分低是影響顱腦損傷患兒繼發(fā)癲癇的獨立危險因素，提示顱腦損傷程度越高，發(fā)生繼發(fā)性癲癇風險越高。以往研究發(fā)現，穿透性顱腦損傷患者發(fā)生癲癇的風險較高[8]。本研究結果顯示，與無SE組相比，SE組患兒開放性顱腦損傷比例較高，但與繼發(fā)性癲癇無關，說明雖然開放性顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇發(fā)生率較高，但并不是影響繼發(fā)性癲癇的獨立危險因素，可能因納入患兒數量不多導致。既往研究發(fā)現，多次驚厥是SE發(fā)生的危險因素之一[9]，本研究結果顯示，驚厥發(fā)作次數≥6次是顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險因素，與既往研究相一致，提示頻發(fā)驚厥的顱腦損傷患兒發(fā)生繼發(fā)性癲癇的風險較高。此外，研究顯示合并顱內血腫、蛛網膜下腔出血也是影響繼發(fā)性癲癇發(fā)生的危險因素，臨床針對此類患兒應高度重視，采取有效措施預防治療，以降低其發(fā)生率。

HIF-1α為缺氧狀態(tài)下產生的活性轉錄因子。以往研究發(fā)現，腦損傷發(fā)生后腦組織中HIF-1α表達明顯升高，且HIF-1α分泌至血液中，使血清中HIF-1α表達上調，激活下游靶基因的轉錄，上調血管內皮生長因子(VEGF)或其他因子表達，促進受損血管修復，加速新生血管形成，發(fā)揮對腦組織的保護作用[10]。此外研究發(fā)現，顱腦損傷后腦組織中HIF-1α表達顯著升高，且6 h內維持較高水平，可上調神經細胞對缺氧的耐受性[11]。Li等[12]研究發(fā)現，HIF-1α可通過介導Notch信號參與急性癲癇發(fā)生，阻斷該通路后可下調HIF-1α，降低癲癇發(fā)生率。Yang等[13]研究發(fā)現，硒誘導的癲癇過程中，HIF-1α可通過腫瘤壞死因子-α途徑造成神經細胞死亡。以上研究均表明HIF-1α與腦損傷及癲癇的發(fā)生有關，然而HIF-1α與腦損傷后繼發(fā)癲癇的關系，目前尚不明確。本研究發(fā)現與無SE組相比，SE組患兒血清HIF-1α表達顯著升高，進一步發(fā)現其與GCS評分呈負相關、與驚厥發(fā)作次數呈正相關，表明腦損傷程度越高，驚厥發(fā)作次數越多，則HIF-1α表達越高，提示HIF-1α參與顱腦損傷后繼發(fā)性癲癇發(fā)生過程。ROC分析發(fā)現HIF-1α對顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預測的AUC為0.874，最佳截斷值為1.48，敏感度為75.67%，特異度為86.75%，約登指數為0.624，提示HIF-1α對顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇具有一定的預測價值。

大量研究證實，miRNA異常表達與腦部疾病的發(fā)生有關，Feng等[14]研究發(fā)現，缺血再灌注大鼠腦組織中miR-301a顯著升高。Wang等[15]研究發(fā)現，腦梗死大鼠腦組織中miR-155-5p表達明顯升高，抑制miR-155-5p可增強腦細胞活力。以上研究均表明miRNA與腦部疾病的發(fā)生明顯有關。miR-210是與缺氧有關的miRNA，與組織缺氧/缺血、腫瘤及炎性反應的發(fā)生有關。Wang等[16]研究發(fā)現，腦梗死患者血清miR-210表達顯著升高。Liu等[17]研究發(fā)現，miR-210在膠質母細胞瘤中表達下調，且與患者預后不良有關，進一步研究發(fā)現miR-210通過靶向腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)抑制膠質母細胞瘤細胞的遷移、侵襲。然而目前miR-210與顱腦損傷的關系尚不明確。本研究發(fā)現與無SE組相比，SE組患兒血清miR-210表達顯著升高，且與GCS評分呈負相關，與驚厥發(fā)作次數呈正相關，提示血清miR-210表達水平的增加與顱腦損傷后繼發(fā)性癲癇發(fā)生有關。ROC分析發(fā)現，miR-210對顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預測的AUC為0.856，最佳截斷值為1.43，敏感度為73.08%，特異度為88.05%，約登指數為0.611。提示miR-210在顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇中具有一定的預測價值，有可能作為此類患兒診斷標志物。研究發(fā)現miR-210可通過靶基因參與細胞增殖、凋亡、血管生成等過程，HIF-1α可結合miR-210轉錄位點上游的低氧反應元件，進而調節(jié)miR-210表達[18]。Wang等[19]研究發(fā)現，上調HIF-1α/miR-210信號通路，可減輕低氧性腦損傷大鼠細胞凋亡及線粒體能量代謝紊亂。Liu等[20]研究發(fā)現，miR-210通過靶向HIF-1α保護腎細胞免受缺氧誘導的凋亡。本研究發(fā)現miR-210與HIF-1α呈明顯正相關，推測在顱腦損傷時患兒腦組織出現缺血缺氧，miR-210表達升高，造成HIF-1α表達增加，使腦組織對缺血環(huán)境產生適應性變化。

綜上所述，在顱腦損傷患兒血清中miR-210、HIF-1α表達的增加與繼發(fā)性癲癇發(fā)生有關，可作為判斷顱腦損傷繼發(fā)性癲癇的潛在生物學標志物。然而本研究僅初步探究兩者的相關性，具體機制尚不清楚，仍需后續(xù)深入探究，以期為疾病的診療提供充分的理論基礎。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

汪生毅：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；孫小紅：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；李海棟：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；李佩章：進行統(tǒng)計學分析；王歲英、李玉鵬：課題設計，論文撰寫