不同連作年限高粱生長及根際土壤微生物群落功能多樣性差異

王 磊，樊芳芳，白文斌，聶萌恩，江佰陽，王勁松，武愛蓮，郭 珺

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所，高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太原030031）

高粱（Sorghum bicolorL.Moench）是世界上第 五大谷類作物，具有多重抗逆性[1]，是一種重要的旱地雜糧作物，也是山西老陳醋和汾酒的主要釀造原料，受到鐮刀灣種植結(jié)構(gòu)調(diào)整拉動，高粱成為山西旱作農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要作物[2]。連作都會導(dǎo)致植物病原體富集，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化[3]，最終降低作物產(chǎn)量[4]。隨著高粱訂單農(nóng)業(yè)的發(fā)展，種植企業(yè)為追求經(jīng)濟(jì)效益，長期高強(qiáng)度連續(xù)種植高粱，出現(xiàn)連作障礙現(xiàn)象。因此，高粱連作障礙成為制約山西省高粱可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。

根際是植物與土壤細(xì)菌和真菌共生的特殊微生態(tài)環(huán)境，植物根系分泌物可選擇性地促進(jìn)或抑制特定微生物類群[5]，土壤微生物類群的變化會影響土壤微生態(tài)功能的改變[6]。近年來，有學(xué)者研究認(rèn)為，根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡是造成連作障礙發(fā)生的主要原因[7-8]。植物根際微生物群落較為敏感和迅速地反映根際環(huán)境條件的變化，是根際微生態(tài)的重要組成部分[9]，因此，研究連作根際土壤微生物的變化規(guī)律很有必要。鄒春嬌等[10]對不同連作年限黃瓜基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究發(fā)現(xiàn)，在連作5茬時，栽培基質(zhì)中微生物碳代謝活性、功能多樣性均高于各茬，但在連作11茬后，基質(zhì)中微生物碳代謝活性、功能多樣性均顯著降低，但對羧酸類碳源的代謝明顯升高。秦舒浩等[11]對馬鈴薯連作障礙的研究發(fā)現(xiàn)，隨連作年限不同，馬鈴薯連作根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)代謝多樣性及遺傳多樣性發(fā)生改變，但不同作物在不同連作年限條件下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征有所差異[12]。已有研究表明，連作導(dǎo)致高粱長勢及產(chǎn)量降低，連作根際土壤真菌富集，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化[3，13-14]。但目前不同連作年限條件下，連作高粱根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本研究以高粱連作根際土壤為研究對象，采用BIOLOG-ECO板對根際土壤微生物群落的碳源代謝功能進(jìn)行分析，從功能多樣性角度揭示了高粱根際土壤微生物群落變化，以期為深入研究高粱根際土壤生態(tài)功能及高粱連作障礙機(jī)制提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)于2017年4—7月在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院連棟溫室內(nèi)進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)方法，供試土壤采集于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地高粱連作5 a田、高粱連作10 a田、高粱玉米輪作田，多點(diǎn)采集耕作層0～20 cm土壤并充分混勻。盆栽土的基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下：pH＝8.40，有機(jī)質(zhì)14.16 g/kg，全氮0.98 g/kg，速效磷8.17 mg/kg，速效鉀259.82 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試高粱品種為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所選育的晉雜34號。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)設(shè)置3個處理：C5（高粱連作5 a）、C10（高粱連作10 a）、CK（高粱玉米輪作）；每處理設(shè)置6個重復(fù)，共18盆。每盆裝土5 kg（盆高18 cm，盆內(nèi)徑21 cm），裝盆前將肥料與不同處理土壤充分混勻（施N肥0.2 g/kg，P肥0.15 g/kg，K肥0.15 g/kg），播種前將種子催芽，每盆播20粒，留苗4株到抽穗期。在出苗60 d后破壞性取土樣，抖根法[15]采集高粱根際土壤，根際土壤去除雜質(zhì)后立即保存于-80℃，用于測定微生物功能多樣性。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 作物生長參數(shù)的測定 在出苗后60 d，破壞性采集高粱植株樣本，測定高粱株高、莖粗，并烘干測其生物量。

1.4.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的測定 土壤微生物功能多樣性使用BIOLOG-ECO微平板法測定[16]。稱取相當(dāng)于10 g干土質(zhì)量的根際土壤加入100 mL滅菌的NaCl溶液（0.85% ）中，得到10-1土壤浸提液；200 r/min旋渦振蕩30 min；靜置片刻后梯度稀釋到10-3土壤浸提液，土壤按照每孔150μL加入ECO板，加蓋放置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至168 h，每隔24 h在590 nm下測定吸光值（Biolog Reader 4.2）。每孔平均顏色變化率（AWCD）[17]用于描述土壤微生物代謝活性，BIOLOG-ECO板的31種碳源可分為六大類，即碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類，計(jì)算每類碳源對應(yīng)孔吸光值的平均值，用來表征微生物群落對該類碳源的代謝活性；McIntosh指數(shù)（U）、Shannon-Wiener指數(shù)（H）為分別用于描述土壤微生物群落均勻度及豐富度的指數(shù)[18]。

式中，Ci為第i孔的吸光值，R為空白孔的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；用BIOLOG-ECO板培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類碳源利用及主成分分析，采用SPSS 17.0進(jìn)行不同處理間數(shù)據(jù)的方差分析及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同連作年限對高粱生長的影響

由表1可知，與CK相比，C5和C10顯著抑制了高粱的生長，C5處理高粱的株高、莖粗和生物量分別比CK降低了10.18% 、15.73% 、14.62% ，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），C10處理高粱的株高、莖粗和生物量分別比CK降低了21.28% 、15.73% 、28.46% ，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；比較不同連作年限條件下高粱生長特征可知，C10對高粱生長的抑制作用比C5的抑制作用更大，C10高粱長勢最弱。由此可得，連作顯著抑制高粱生長，連作10 a對高粱的抑制作用大于連作5 a。

表1不同連作年限高粱的生長情況

2.2 不同連作年限對高粱根際土壤微生物代謝活性及功能多樣性的影響

AWCD（每孔平均顏色變化率）反映土壤微生物對31種碳源的平均利用能力，可表征高粱根際土壤微生物群落的代謝活性。隨著培養(yǎng)時間的延長，根際微生物對碳源代謝能力逐漸增加，到168 h時逐漸趨于平緩，在培養(yǎng)過程中，C10的AWCD值均顯著高于C5和CK處理，而C5的AWCD值低于CK處理（圖1）。在培養(yǎng)96 h時，C10的AWCD值分別是C5和CK的2.05倍、1.47倍（P＜0.05），C5的AWCD值比CK降低了28.57% （P＜0.05）（表2）。這表明，連作5 a降低了高粱根際土壤微生物代謝活性，而連作10 a增加了根際土壤微生物的代謝活性。

表2不同連作年限高粱根際土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù)

對培養(yǎng)96 h數(shù)據(jù)進(jìn)行碳源代謝多樣性分析，結(jié)果 顯 示，C10的McIntosh指 數(shù) 分 別 是C5、CK的2.08倍、1.45倍（P＜0.05），Shannon多樣性指數(shù)分別比C5、CK處理增加了2.74% 、4.17% （P＜0.05）。C5的McIntosh指 數(shù)比CK降低 了30.15% （P＜0.05），但C5的Shannon多樣性指數(shù)與CK相比差異不顯著。這表明連作10 a高粱根際土壤微生物群落對碳源代謝的多樣性及均勻性顯著增加，但連作5 a時高粱根際土壤微生物群落代謝活性及代謝均勻性降低，但代謝碳源的多樣性差異不大（表2）。

2.3 不同連作年限對高粱根際土壤微生物群落分類碳源代謝活性的影響

根據(jù)官能團(tuán)的不同，可將BIOLOG-ECO板的31種碳源分為6大類，C10對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類的代謝分別是CK的1.63倍、1.53倍、2.62倍，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），而C10對多聚物類、酚酸類、胺類的代謝與CK處理差異不顯著。與CK相比，C5對碳水化合物類、氨基酸類、多聚物類、酚酸類、胺類的代謝均顯著降低，而C5對羧酸類的代謝比CK顯著增加，其對羧酸的代謝活性是CK的2.48倍（P＜0.05）。這表明，連作10 a增加了高粱根際微生物對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類的利用能力，而連作5 a增加了高粱根際微生物對羧酸類的利用能力，但對其余5類碳源的利用能力均降低（表3）。

表3不同連作年限高粱根際土壤微生物群落的分類碳源代謝活性

不同處理根際土壤微生物對31種碳源代謝的 值進(jìn)行熱圖聚類分析（圖2），與CK相比，C5降低了對碳水化合物類（B3，D-Galacturonic Acid、E2，NAcetyl-D-Glucosamine、D2，D-Mannitol、F2，D-Glucosaminic Acid）、氨基酸類（B4，L-Asparagine）、多聚物類（C1，Tween 40）的代謝能力，但C5增加了對羧酸類（H3，D-Malic Acid）的代謝能力；C10增加了對碳水化合物類（B2，D-Xylose、H1，a-D-Lactose、G1，D-Cellobiose、A2，β-Methyl-D-Glucoside）、羧酸類（H3，D-Malic Acid）的代謝能力。

2.4 不同連作年限高粱根際土壤微生物群落碳源利用能力的主成分分析

圖3中連接原點(diǎn)和碳源的向量長度可度量微生物碳源代謝能力差異的貢獻(xiàn)值，向量越長表示該碳源對微生物代謝差異的貢獻(xiàn)值越大。從圖3可以看出，C5和C10在PC1上分異較大，而CK在PC2上與C5、C10分異較大；碳水化合物類（CB）對各處理分異貢獻(xiàn)最大，其次為多聚物類（PO）、氨基酸類（AA）、羧酸類（CA）。

3 結(jié)論與討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，多種作物都會出現(xiàn)連作障礙現(xiàn)象[15，19-20]。LIU等[19]報(bào)道，隨著大豆連作年限的延長，大豆產(chǎn)量逐年下降。XIONG等[20]研究表明，長期連作顯著影響黑胡椒長勢。已有研究表明，高粱不耐連作，連作3 a后高粱生長和產(chǎn)量明顯下降[13]，且隨著連作年限的增加，高粱單株產(chǎn)量、單株干物質(zhì)量持續(xù)降低[21]。本研究也證實(shí)了這一結(jié)論，與輪作對照相比，連作高粱長勢減弱，連作10 a高粱株高、莖粗和生物量均顯著低于連作5 a。

根際是植物-土壤-微生物相互作用的中心，根際土壤微生物可敏感反映土壤環(huán)境的變化[22]。BIOLOG-ECO微平板法可以從微生物碳源代謝角度，反映土壤微生物代謝活性及代謝功能多樣性[10]。本研究顯示，相比輪作，高粱連作5 a時根際土壤的AWCD值、功能多樣性指數(shù)降低，而連作10 a時AWCD值、功能多樣性指數(shù)升高，但不同連作年限都顯示出對羧酸類代謝能力增加。岳冰冰等[23]對連作7 a煙田土壤微生物功能多樣性的研究表明，連作明顯降低了煙田土壤微生物碳源利用能力，烤煙連作后土壤微生物代謝活性及功能多樣性降低。已有研究表明，烤煙連作后土壤中真菌比例顯著增加，破壞了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的平衡[24]，隨烤煙連作年限的增加細(xì)菌多樣性指數(shù)呈下降趨勢，真菌多樣性指數(shù)有上升趨勢[25]。對馬鈴薯、黃瓜連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究也有相似結(jié)論，隨著連作年限的增加，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和豐富度持續(xù)下降。孟品品等[26]研究發(fā)現(xiàn)，連作馬鈴薯會增加土壤中真菌類病原菌鐮刀菌。然而基于不同作物，不同連作年限土壤微生物群落多樣性的變化也有不同報(bào)道。朱琳等[27]對大豆不同連作年限的研究表明，連作10 a以上大豆土壤微生物群落的豐富度和多樣性增加。劉株秀等[28]的研究也有一致規(guī)律，與大豆、玉米輪作體系相比，連作13 a大豆土壤微生物群落豐富度和多樣性顯著高于連作3 a和連作5 a。寇智瑞等[29]對不同連作年限黃壤煙田土壤細(xì)菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，煙田連作5 a內(nèi)土壤微生物群落多樣性和豐富度逐漸上升，連作5 a時微生物群落豐富度最高，煙田連作8 a后土壤微生物群落豐富度與植煙1 a相比顯著降低，隨連作年限的增加，微生物豐富度下降更加明顯。本研究表明，隨連作年限的增加，高粱根際土壤中微生物的代謝活性及代謝功能多樣性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且不同連作年限都表現(xiàn)出對D-蘋果酸的代謝活性增加，造成這一現(xiàn)象的原因可能與高粱根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化及高粱獨(dú)特的根系分泌物有關(guān)。隨著高粱連作年限的增加，土壤中真菌類有害菌群富集[14]，打破了土壤微生態(tài)平衡，進(jìn)而降低土壤微生物群落的代謝活性，但隨著連作年限的增加，根系分泌物烴類和酯類化合物逐漸增加[21]，可能促進(jìn)代謝此類物質(zhì)的微生物繁殖，并在高粱根際逐年富集。本研究中，連作高粱根際對羧酸類代謝增加，也間接佐證了這一觀點(diǎn)。

綜上所述，連作導(dǎo)致高粱長勢減弱，根際土壤微生物代謝活性及功能多樣性發(fā)生變化，隨著連作年限的增加，作物長勢受到的抑制作用增加，但高粱根際土壤微生物代謝多樣性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。本研究采用BIOLOG-ECO技術(shù)從代謝角度研究不同連作年限條件下高粱根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，下一步仍需借助分子生物學(xué)方法明確連作年限的變化、根際土壤微生物的基因多樣性的變化以及根系分泌物富集哪些關(guān)鍵微生物菌群，探究高粱連作障礙機(jī)制。