HPLC-ELSD法測定不同產(chǎn)地、劑型黃芪飲片中黃芪甲苷含量

馬 寧，郝 娟，王景雪

（1.太原市食品藥品檢驗所，山西太原030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

中藥材黃芪最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名北芪或黃耆[1]?！吨袊幍洹罚?015版）中規(guī)定：黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，氣微，味微甜，嚼之微有豆腥味，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、脫毒排膿、斂瘡生肌等功效[2]。黃芪含有許多化學(xué)成分，主要為黃酮類、皂苷、多糖類及氨基酸[3]。研究表明，黃芪中含量最多的是黃芪多糖、蛋白多糖，其總量占22%[4]。黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是黃芪中一種關(guān)鍵物質(zhì)，是蒙古黃芪和膜莢黃芪中主要活性成分之一，是評價藥材質(zhì)量的重要指標[5-7]，具有抗腫瘤、抗高血壓、消炎[8]、增強免疫力[9]、增強機體抗病能力[10]、改善心肺功能等作用[11]，同時黃芪甲苷在肌纖維化[12]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13]、糖尿病[14]、腎病[15]等中的作用也有研究報道。

本試驗以黃芪甲苷為指標，通過對涉及9個不同產(chǎn)地的黃芪樣品18份，以及甘肅定西產(chǎn)炙黃芪2份、黃芪配方顆粒2份、黃芪破壁飲片1份共計23份樣品的黃芪甲苷含量進行測定比較，以確定最佳的黃芪產(chǎn)地，并對常見商品化黃芪的質(zhì)量作出評價。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為從太原市藥店采購以及網(wǎng)絡(luò)渠道采購的黃芪樣品（表1），樣品經(jīng)粉碎過（250±9.9）μm篩，備用；黃芪甲苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201717。

表1黃芪樣品信息

1.2 試劑

正丁醇、甲醇、無水乙醇均為分析純；一級純化水、D101大孔吸附樹脂、氨水；乙腈為色譜純。

1.3 儀器

Waters e2695 Separations Module液相色譜儀、waters 2424 ELSD檢測器（上海沃特世有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）；梅特勒ME204型萬分之一天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 高效液相色譜法采用waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫30℃；以乙腈-水（體積比為32∶68）為流動相，流速1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度50℃；載氣壓力35 psi。

1.4.2 溶液制備

1.4.2.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，即得。

1.4.2.2 供試液的制備 將樣品粉碎，過（250±9.9）μm篩，精密稱取粉末4 g，加入甲醇40 mL冷浸過夜，用索氏抽提法加熱回流提取4 h，濃縮提取液至干，殘渣用10 mL水溶解，再用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，將正丁醇液水浴蒸發(fā)徹底，殘留物用5 mL水溶解，將水溶液通過D101大孔吸附樹脂（內(nèi)徑1.8 cm，柱高20 cm），并且先用50 mL水洗脫，棄去水溶液后，再用40% 乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70% 乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸發(fā)徹底，用適量甲醇溶解殘渣，并將甲醇溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系分析

分別精密吸取對照品溶液20、40μL，注入液相色譜儀，按照1.4.1方法進行測定，如圖1所示。用外標兩點法對數(shù)方程計算，即以黃芪甲苷對照品進樣量的對數(shù)值（X）為橫坐標、峰面積積分值的對數(shù)值（Y）為縱坐標，得到方程Y＝1.717 1X＋5.196 8（R2＝1）。

2.2 精密度試驗

取樣品HQ-1作為供試品，按照1.4.2.2方法制成供試品溶液，并在1.4.1色譜條件下重復(fù)進樣，共計5次，計算峰面積。結(jié)果表明，5次進樣峰面積RSD為0.41% ，說明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

取HQ-1樣品，按照1.4.2.2方法重復(fù)稱取5份，每份4 g，并制成供試品溶液，在1.4.1色譜條件下連續(xù)進樣，測定峰面積。結(jié)果表明，5次進樣峰面積RSD為1.03% （n＝5），小于3% ，說明樣品重復(fù)性較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取樣品HQ-2按照1.4.2.2方法制成供試液后，在0、2、4、6、8、12、24 h分別進樣，在1.4.1色譜條件下測定峰面積，測得RSD為0.47% ，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率試驗

表2黃芪中黃芪甲苷含量的回收率結(jié)果

精密稱取已知含量的樣品2 g，根據(jù)樣品中含有的黃芪甲苷的含量加入適量的對照品溶液，按照1.4.2.2制備供試液，在1.4.1色譜條件下進行測定，計算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為98.38% ，RSD為0.97% （表2），說明黃芪中黃芪甲苷含量的回收率符合要求。

2.6 樣品測定結(jié)果

將2.1中樣品按照1.4.2.2制備方法制成供試液，并按照1.4.1方法進行液相色譜分析，得到結(jié)果運用2.1中方程計算，具體含量如表3所示。其中個別樣品色譜分析如圖2所示。

由表3可知，所有黃芪樣品的色譜峰與黃芪甲苷對照品的色譜峰相對保留時間一致，但不同樣品的峰面積有所差異，對應(yīng)的黃芪甲苷含量也不同，在不同產(chǎn)地黃芪中，產(chǎn)自于甘肅定西的黃芪中黃芪甲苷含量最大，為0.075 2% ，而產(chǎn)自四川理塘縣的黃芪中黃芪甲苷含量最低，為0.020 1% （圖2）；黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量要明顯多于黃芪配方顆粒，前者約為后者的2倍。所有黃芪樣品，除了四川理塘產(chǎn)黃芪外，黃芪甲苷含量均滿足《中國藥典》（2015版）中最低限量要求（標準規(guī)定：黃芪含黃芪甲苷含量不得少于0.040% ，炙黃芪不得少于0.030% ）。

表3黃芪甲苷測定結(jié)果 %

3 結(jié)論與討論

由于近些年來人們的保健意識增強，黃芪用量逐漸增大，而且隨著人們對生活品質(zhì)要求的提高，消費者的注意力更多地集中于產(chǎn)品的品質(zhì)，所以，對黃芪進行質(zhì)量評價具有很重要的意義。雖然中藥材黃芪的產(chǎn)地豐富，包括內(nèi)蒙古、甘肅、黑龍江、山西等，但是不同產(chǎn)地的地質(zhì)及氣候條件使得黃芪質(zhì)量也不同[16]，比如在青海、四川等地種植的黃芪較主產(chǎn)地甘肅、內(nèi)蒙黃芪來說，其質(zhì)量往往差異很大。

本研究選取9個不同產(chǎn)地的黃芪共18批，其中包括內(nèi)蒙古、甘肅、山西等主產(chǎn)地，也包括四川、寧夏等非主產(chǎn)地黃芪；甘肅產(chǎn)炙黃芪2批，還有黃芪配方顆粒2批，破壁飲片1批，共計23批次，而且所有黃芪正品樣品中除四川理塘黃芪外，黃芪甲苷含量均符合《中國藥典》標準規(guī)定，說明市場上黃芪質(zhì)量普遍較好。從黃芪甲苷含量來看，甘肅定西黃芪最高，山西渾源次之，河北、黑龍江再次，而一直以來較少報道的寧夏六盤山產(chǎn)黃芪中黃芪甲苷含量為0.054 1% ，超過廣西玉林、四川理縣、青海等地位列第5，含量最少的為四川理塘縣黃芪，其次為內(nèi)蒙古呼倫貝爾產(chǎn)黃芪（HQ-4）。

黃芪破壁飲片中黃芪甲苷含量在所有被測樣品中最高，而來自于山西省中醫(yī)研究所的黃芪配方顆粒中，黃芪甲苷的含量較低。雖然這2種黃芪均作為常見藥品出售，而且均為顆粒劑，但是含量差異較大。經(jīng)過查閱相關(guān)資料，黃芪破壁飲片采用超微氣流粉碎技術(shù)對植物細胞進行破裂，使得固體物料被打成粒徑小于10μm的微粉，然后制成顆粒，并未經(jīng)過長時間的煎煮過程，這樣就使得有效成分被充分的暴露出來，從而更容易被檢測到。而中藥配方顆粒則只是在傳統(tǒng)的煎煮方式上進行了改良，對個別名貴的動物藥或者以粉末入藥的藥材選擇超微破壁方法，大部分中藥配方顆粒的制作過程與傳統(tǒng)的煎煮方式并無二異，使得物料在煎煮過程中有效成分損失。所以，其有效成分的含量與中藥飲片相比有所降低[17]。

在不同產(chǎn)地的黃芪中，四川理塘縣黃芪的黃芪甲苷含量最低，在與黃芪甲苷對照品相應(yīng)的保留時間附近，只有一個微弱的峰，而在保留時間3.00～5.00 min處，有2個很明顯的峰，說明在四川黃芪中這2種對應(yīng)的物質(zhì)要比其他產(chǎn)地的黃芪多，具體為何種物質(zhì)有待進一步檢測[18]。本試驗中，甘肅產(chǎn)炙黃芪為《中國藥典》（2015版）收錄的經(jīng)蜜炙法后所得黃芪，與生飲片相比，其黃芪甲苷的含量降低了13.4% ，通過查閱文獻[19]可知，不同的炮制方式會對黃芪甲苷的含量產(chǎn)生不同的影響，可見通過炮制后會對黃芪甲苷的含量有所影響。