外源NO對(duì)鎘脅迫下大豆幼苗生理特性的影響

楊玉花，白志元，張瑞軍，衛(wèi)保國(guó)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所），山西太原030031）

鎘是植物體內(nèi)的非必需元素，有轉(zhuǎn)移快、難降解、毒性大的特點(diǎn)。隨著我國(guó)城市化和工業(yè)化的進(jìn)行，工業(yè)廢水、廢渣攜帶大量鎘離子滲透入土壤中。同時(shí)純度不高的農(nóng)藥和化肥中都有鎘離子的殘留，無(wú)節(jié)制的施用均導(dǎo)致了農(nóng)田土壤中鎘含量急劇增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)受鎘元素等重金屬污染的農(nóng)業(yè)用地將近2 000萬(wàn)hm2，約占全國(guó)農(nóng)業(yè)用地總面積的20% 。耕地中鎘元素的不斷增加，已經(jīng)成為影響我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)及食品安全的重要隱患。趙毅等[1]研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下，大豆幼苗根和葉的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制；邱志勇[2]研究表明，鎘脅迫會(huì)降低大豆幼苗的光合色素含量，對(duì)光合作用產(chǎn)生嚴(yán)重阻礙；劉強(qiáng)等[3]研究發(fā)現(xiàn)，鎘離子可使煙草細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量O2-和H2O2等活性氧，從而損傷植物細(xì)胞，產(chǎn)生鎘脅迫反應(yīng)。

一氧化氮（NO）是植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子，能夠調(diào)控植物體內(nèi)多個(gè)生長(zhǎng)途徑和不同途徑中多個(gè)基因的表達(dá)。目前已經(jīng)證實(shí)的通路包括NO合成酶途徑、硝酸還原酶、亞硝酸還原酶途徑，并且這些途徑廣泛參與到其他信號(hào)通路[4-5]。李莉等[6-7]研究表明，適宜濃度的外源NO可以有效提高幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)，增加植物體內(nèi)光合色素的含量，增強(qiáng)植物的光合作用。馬曉麗等[8]研究表明，在鎘脅迫下，NO可以通過(guò)提高抗氧化酶的活性來(lái)減弱鎘離子脅迫對(duì)小麥產(chǎn)生的負(fù)作用。近年來(lái)，隨著鎘污染情況越來(lái)越嚴(yán)重，科研工作者進(jìn)行了大量關(guān)于緩解植物鎘脅迫的研究。然而，關(guān)于外源NO對(duì)鎘脅迫下大豆生理影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究開(kāi)展了外源NO緩解大豆幼苗鎘脅迫的效應(yīng)試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定大豆幼苗期生理指標(biāo)，研究可緩解大豆鎘脅迫的最適硝普鈉（SNP）濃度，以期為鎘污染防治和土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆品種為晉豆48號(hào)，是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所雜交大豆課題組于2014年通過(guò)山西省農(nóng)作物品種委員會(huì)審定的一個(gè)大豆雜交種。

鎘離子供體為Cd（NO3）2，購(gòu)自山西飛達(dá)生物科技有限公司。NO供體為Na2［Fe（CN）5NO］·2H2O（硝普鈉，SNP），購(gòu)自山西飛達(dá)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā) 選取均勻無(wú)病害的晉豆48號(hào)大豆種子，用滅菌水在室溫下浸泡6～8 h。然后用75% 乙醇沖洗30 s，15% 的NaClO沖洗20 min，滅菌水洗滌3次，放入真空干燥箱40℃烘干1 h。試驗(yàn)設(shè)CK（處理液為滅菌水）和6個(gè)處理組，6個(gè)處理組中均添加0.5 mmol/L的Cd（NO3）2，pH值控制在5.4，并分別添加濃度為0、50、100、150、200、300μmol/L SNP溶液，分別命名為NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300。將大豆種子置于9 cm培養(yǎng)皿中的濾紙上，濾紙用不同濃度的SNP溶液處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30粒種子。大豆種子于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，避光催芽3 d，在光照/黑暗12 h/12 h、相對(duì)濕度70% 下進(jìn)行培養(yǎng)，此后每天以滅菌水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的液體。

1.2.2 大豆幼苗形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量 將1.2.1培養(yǎng)7 d后的晉豆48號(hào)大豆幼苗進(jìn)行莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)等形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 大豆幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 將1.2.1培養(yǎng)10 d后的晉豆48號(hào)大豆幼苗進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定：避光條件下在丙酮∶乙醇為1∶1（V/V）的溶液中磨碎晉豆48號(hào)大豆幼苗葉片，然后分別在470、649、665 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

SOD、POD和CAT活性采用彭艷等[9]的方法測(cè)定；APX活性采用陳海霞等[10]的方法測(cè)定；根尖O2-和H2O2含量采用ZHOU等[11]的方法，取根尖1 cm測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel整理數(shù)據(jù)和作圖，采用SAS v8軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)鎘脅迫下大豆幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由圖1可知，6個(gè)添加了鎘離子的處理NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300在7 d的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均顯著短于未添加鎘離子的CK，根長(zhǎng)較CK分別降低79.08% 、55.60% 、31.75% 、59.52% 、67.56% 和75.64% ；莖長(zhǎng)較CK分別降低74.49% 、59.70% 、39.15% 、55.69% 、69.41% 和76.95% 。說(shuō)明鎘脅迫對(duì)大豆的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用。在存在鎘脅迫的6個(gè)處理中，添加了SNP的NO-50、NO-100、NO-150、NO-200處理的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)均大于未添加SNP的NO-0處理，根長(zhǎng)較NO-0處理增幅分別為112.30% 、226.32% 、93.56% 和55.08% ；莖長(zhǎng)較NO-0處理增幅分別為57.96% 、138.49% 、73.66% 和19.89% 。說(shuō)明SNP可有效緩解鎘離子脅迫對(duì)大豆根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的影響。其中，SNP濃度為100μmol/L的處理NO-100的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)最長(zhǎng)，分別為7.6、7.39 cm。NO-300處理的大豆莖長(zhǎng)小于NO-0處理，降幅為9.68% ，說(shuō)明較高的SNP濃度反而會(huì)降低其緩解鎘脅迫的作用。

2.2 外源NO對(duì)鎘脅迫下大豆幼苗葉片光合色素含量的影響

從圖2可以看出，在鎘脅迫下的NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理在葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量上均顯著少于未添加鎘離子的CK，葉綠素a較CK分別降低47.02% 、31.42% 、17.76% 、38.04% 、43.50% 、48.59% ，葉綠素b較CK分別降低49.88% 、23.25% 、16.00% 、27.75% 、49.13% 、57.25% ，類(lèi)胡蘿卜素較CK分別降低56.45% 、30.49% 、18.02% 、41.79% 、53.36% 、61.22% 。說(shuō)明鎘脅迫對(duì)大豆葉片的光合色素含量有較強(qiáng)的抑制作用。在相同濃度的鎘離子脅迫下，施加SNP的濃度為100μmol/L時(shí)，大豆幼苗葉片的葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素含量有顯著提高；其中，與未添加SNP處理NO-0相比，葉綠素a含量增加54.97% ，葉綠素b含量升高47.33% ，類(lèi)胡蘿卜素含量升高86.73% 。NO-300處理的大豆幼苗葉片各色素含量均顯著下降，說(shuō)明這個(gè)濃度的SNP對(duì)大豆的光合作用產(chǎn)生了抑制作用。

2.3 外源NO對(duì)鎘脅迫下大豆幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的SOD活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，較CK分別降低33.12% 、24.44% 、10.29% 、25.06% 、32.19% 和45.59% ，說(shuō)明鎘離子對(duì)大豆體內(nèi)的SOD活性有較強(qiáng)的抑制作用。在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對(duì)大豆葉片中的SOD活性有顯著影響，其中，NO-50、NO-100、NO-150處理較NO-0處理的SOD活性均有提高，增幅分別為12.97% 、34.13% 、12.04% 。NO-300處理的SOD活性較NO-0處理有較大的下降，降幅為18.64% ，說(shuō)明較大濃度的SNP會(huì)造成SOD活性的降低。

由圖4可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的CAT活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，降幅分別為49.20% 、38.67% 、7.09% 、26.65% 、34.48% 、47.34% 。且在鎘脅迫下，不同濃度SNP對(duì)大豆葉片中的CAT活性有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的CAT活性較NO-0處理均有不同程度增加，增幅分別為25.91% 、90.76% 、50.61% 、34.53% 和8.13% 。

由圖5可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的POD活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，降幅分別為30.80% 、11.03% 、4.48% 、16.09% 、27.93% 和39.54% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對(duì)大豆葉片中的POD活性有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200處理的POD活性較NO-0處理均有增加，增幅分別為28.36% 、37.81% 、21.06% 、3.98% 。

由圖6可知，鎘脅迫下，NO-0處理大豆葉片APX活性較CK有顯著下降，降幅為41.61% ，說(shuō)明鎘脅迫對(duì)大豆葉片中APX活性有明顯的抑制作用。處于鎘脅迫下的NO-100處理的APX活性不僅高于NO-0處理，同時(shí)還顯著高于未添加鎘離子的CK，較CK增加28.36% 。說(shuō)明適量的SNP不僅可以抵消鎘脅迫對(duì)大豆葉片中APX活性的影響，還可以大幅提升APX活性。NO-50、NO-150、NO-200處理的APX活性，均顯著高于未添加SNP的NO-0處理，同時(shí)較CK下降不明顯，較CK分別下降8.49% 、2.07% 和22.98% 。

由圖7可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的葉片O2-產(chǎn)生速率均不同程度高于未處于鎘脅迫的CK，增幅分別為81.14% 、57.89% 、22.38% 、42.73% 、51.14% 和71.49% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對(duì)大豆根部中的O2-產(chǎn)生速率有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300處理的O2-產(chǎn)生速率較NO-0處理均有不同程度降低，降幅分別為12.83% 、32.44% 、21.20% 、16.56% 和5.32% 。

由圖8可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的葉片H2O2含量均不同程度高于未處于鎘脅迫的CK，增幅分別為58.03% 、41.32% 、10.21% 、25.23% 、34.88% 和51.36% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對(duì)大豆根部中的H2O2含量有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300處理的H2O2含量較NO-0處理均有不同程度的降低，降幅分別為10.57% 、30.26% 、20.75% 、14.64% 和4.22% 。

3 結(jié)論與討論

鎘是大豆體內(nèi)的非必需元素，會(huì)對(duì)大豆的正常生長(zhǎng)起到抑制作用，降低大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。鎘離子可損害大豆的根系，降低主根的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量，甚至?xí)斐筛康幕螇乃繹13]。同時(shí)鎘離子也會(huì)破壞大豆的光合系統(tǒng)，降低葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素的含量，抑制光合作用[14]。NO是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要信號(hào)分子[15]。陳秀蘭等[16]研究表明，在鎘脅迫下施用外源NO可以有效緩解鎘離子對(duì)水稻根的影響。張茜等[17]在棉花上的研究表明，適量的外源NO可增加植物體內(nèi)葉綠素的含量，增加葉綠素相關(guān)基因的表達(dá)量，從而增強(qiáng)植物的光合作用。

本研究結(jié)果表明，較高濃度的鎘脅迫對(duì)大豆幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。而適當(dāng)濃度的外源NO可以有效減弱鎘脅迫對(duì)大豆幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)產(chǎn)生的副作用。這與于肇端等[18]在黃瓜上、巴青松等[19]在小麥上、李燕歌[20]在甜茶上的研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度鎘離子會(huì)嚴(yán)重?fù)p害大豆的光合系統(tǒng)，而添加100μmol/L SNP可以有效緩解鎘脅迫，提高植物光合色素的含量，改善其大豆葉片的光合作用。一方面可能是因?yàn)樾盘?hào)分子NO提高了類(lèi)囊體膜蛋白的穩(wěn)定性，從而降低了鎘脅迫對(duì)類(lèi)囊體膜的破壞作用；另一方面可能是由于NO激活了大豆葉片中的葉綠素表達(dá)基因，從而提高了光合色素的含量[15]。大量研究表明[21-22]，鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量氧的自由基，造成植物細(xì)胞膜過(guò)氧化，從而引起一系列的生理紊亂。在較低濃度的鎘脅迫環(huán)境下，植物通過(guò)提高自身POD、SOD、CAT等保護(hù)酶活性和APX等抗氧化物酶活性，來(lái)維持體內(nèi)氧的自由基產(chǎn)生和消耗的動(dòng)態(tài)平衡。但是高濃度的鎘離子會(huì)占據(jù)或替換保護(hù)酶和抗氧化物酶的活性中心，從而降低酶活性，無(wú)法行使正常功能，進(jìn)而影響種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和光合作用[23-25]。本研究表明，在鎘脅迫下大豆幼苗葉片中的POD、SOD、CAT和APX活性顯著下降，根尖的O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著上升，而通過(guò)加入100μmol/L SNP可有效提高大豆幼苗葉片中的保護(hù)酶和抗氧化物酶活性，降低活性氧的含量。

本研究以在高濃度鎘脅迫下的晉豆48號(hào)為材料，探究了不同濃度SNP對(duì)大豆幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，適宜濃度的外源NO可以促進(jìn)大豆種子萌發(fā)，增加葉片中光合色素含量，提高POD、SOD、CAT和APX活性，降低根尖的O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量，從而有效緩解鎘脅迫對(duì)大豆造成的傷害。