紫外分光光度法測定蚓激酶效價方法研究

李嵐 李文貴 周清瑤 秦巧莉

（江中藥業(yè)股份有限公司 江西南昌330004）

蚯蚓纖溶酶（Earthworm Fibrinolytic Enzyme, E FE）又稱作蚓激酶（Lumbrokinase,LK），是從赤子愛勝蚓體內(nèi)提取的一組具有纖溶活性的蛋白水解酶。自1983 年Mihara 等從蚯蚓粗提物中分離到一組具有纖溶酶活性的蛋白質以來，蚓激酶作為溶栓藥物已先后在韓國和中國上市，對血栓性疾病有明顯的療效[1]。平板法是目前較為常用的定量方法，用于蚓激酶效價的測定。但在實驗操作中，鋪板、打孔、點樣和計數(shù)時出現(xiàn)導致操作誤差，并且該檢測方法耗時長、效率低，檢測使用的蚓激酶標準品、凝血酶和牛纖維蛋白原等試劑成本較高。蚓激酶中的蛋白質在堿性溶液中會與Cu2+鰲合，形成肽-銅復合物，此復合物可使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，該藍色化合物在650 nm 處的吸光度與蛋白質含量成正比，再以蚓激酶標準品作為對照可計算樣品效價。紫外分光光度法的建立正是基于以上原理?，F(xiàn)報道如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器 MS204-S 電子天平（瑞士梅特勒-特利多公司）；UV2550 紫外分光度計（日本島津公司）；旋渦震蕩器（江蘇金壇億通電子有限公司）。

1.2 試藥與試劑 蚓激酶標準品［215 000 U/支，為江中藥業(yè)股份有限公司自制，批號為201809，使用中國食品藥品檢定院蚓激酶標準品（編號140650-200502） 進行標定］；蚓激酶干粉（批號18100004-1、18100005-1、18100005-2）、30 萬蚓激酶腸溶膠囊（批號18090023、18100024、18100027）和60 萬蚓激酶腸溶膠囊（批號18110001、18110002、18110003）為江中藥業(yè)股份有限公司提供；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 波長的選擇[2～3]

2.1.1 標準品溶液的制備 取蚓激酶標準品1 支，用磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）制備成4 300 U/ml的蚓激酶標準品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取30 萬蚓激酶腸溶膠囊（批號18090023）28.0 mg，用37 ℃磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）制成每1 ml 中含蚓激酶6 000 U 的溶液。另蚓激酶干粉（批號18100004-1），同法制備成0.5 mg/ml 的溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 稱取14.0 mg 空白微丸、7.3 mg 腸溶包衣材料，溶于10 ml 磷酸鹽緩沖液（pH 值6.8）中，作為陰性樣品溶液。

2.1.4 測定 取以上溶液，分別在200～600 nm 波長進行掃描，陰性樣品溶液未檢出紫外最大吸收峰，30 萬蚓激酶腸溶膠囊和蚓激酶干粉溶液紫外最大吸收峰波長均在約650 nm 處，因此，選取650 nm為最佳測定波長。見圖1～圖3。

圖1 蚓激酶標準品光譜吸收圖

圖2 蚓激酶樣品光譜吸收圖

圖3 陰性樣品光譜吸收圖

2.2 研究方法

2.2.1 標準品溶液的制備 取蚓激酶標準品1 支，用磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）制備成21 500 U/ml的標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 蚓激酶干粉取約10 mg（30 萬蚓激酶腸溶膠囊取內(nèi)容物約180 mg、60 萬蚓激酶腸溶膠囊內(nèi)容物約300 mg），精密稱定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻備用。

2.2.3 標準曲線的制備 取標準品溶液，分別精密量取0、0.10 ml、0.30 ml、0.50 ml、0.70 ml、1 ml 置于10 ml 具塞試管中，分別加入磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.8）至1 ml。加入堿性Cu2+溶液5 ml，放置10 min?？焖偌尤敕釉噭?.5 ml，充分搖勻。30 ℃水浴30 min，取出放冷，在650 nm 波長依法測定。以樣品量為橫坐標，吸收度為縱坐標繪制標準曲線。結果表明在2 150～21 500 U 范圍內(nèi)，相關系數(shù)為0.996 3，線性關系良好。見圖4。

圖4 蚓激酶標準曲線

2.2.4 樣品測定 取蚓激酶干粉、30 萬蚓激酶腸溶膠囊、60 萬蚓激酶腸溶膠囊各3 批，按照供試品溶液制備方法制備，分別精密量取0.50 ml（60 萬蚓激酶腸溶膠囊取0.25 ml）具塞試管中，加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）至1 ml 依法測定。效價測定結果見表1。

表1 樣品效價測定結果

2.3 方法學考察[4～6]

2.3.1 準確度試驗 供試品溶液的制備：蚓激酶干粉（批號18100005-2）取10 mg，精密稱定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻備用。精密量取供試品溶液0.25 ml 具塞試管中，分別精密加入對照品溶液0.25 ml、0.35 ml、0.40 ml，加磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.8）至1 ml，作為供試品Ⅰ組（80%）、供試品Ⅱ組（100%）、供試品Ⅲ組（120%）。依法測定吸收度，各重復測定3 次。另取磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）依法測定，作為空白。結果供試品Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組平均回收率為99.2%，RSD 為0.38%，準確度試驗符合測定要求。見表2。

表2 準確度試驗結果

2.3.2 重復性試驗 供試品溶液的制備：蚓激酶干粉（批號：18100005-2）取10 mg，精密稱定，置于10 ml 容量瓶中，用37 ℃磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻備用，作為供試品溶液。取供試品溶液依法測定吸收度，重復測定6 次。另取磷酸鹽緩沖溶液（pH 值6.8）作為空白，依法測定。6 次測定的平均吸收度為0.785，RSD 為0.47%，重復性試驗符合規(guī)定。見表3。

表3 重復性試驗結果

2.4 樣品效價測定結果 取蚓激酶干粉、30 萬蚓激酶腸溶膠囊與60 萬蚓激酶腸溶膠囊各3 批，按照2.2.4 中方法制備供試品溶液，避光與傳統(tǒng)生物平板法測定結果比較，結果相近。見表4。

表4 樣品效價測定結果

3 討論

本研究中，進行光譜掃描所用的蚓激酶標準溶液濃度為4 300 U/ml，其吸光度僅為0.165，吸光度太低。同時供試品溶液稀釋1 000 倍，導致吸光度太低，誤差大。效價結果重現(xiàn)性不好，所以該方法不適用，需調整標準品及供試品溶液濃度，在后續(xù)的實驗中我們進行了調整。

本研究建立的紫外分光光度法測定蚓激酶效價方法，條件易控制，操作較簡便迅速，試劑成本較低，方法準確。效價結果與生物平板法測定效價結果相近。因此，本方法適用于蚓激酶及腸溶膠囊的效價測定。