白消安對U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新的影響

趙艦，張良龍，金亮，張維，蘭偉途

作者單位：滄州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 滄州061000

研究發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)干細(xì)胞的實驗理論方法應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤病人的瘤灶中存在腫瘤干細(xì)胞，其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。目前臨床中對于膠質(zhì)瘤的治療原則主要為抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤擴(kuò)散的目的［2］。白消安為臨床中緩解性治療慢性粒細(xì)胞白血病的常用藥物之一，或者與其他藥物聯(lián)合使用，清除體內(nèi)造血干細(xì)胞，為慢性髓性白血病病人進(jìn)行干細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)［3］。白消安應(yīng)用于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究較少，因此，本研究于2018年1月至2019年1月，探究白消安對U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新的影響。具體報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供；白消安由Sigma 公司提供，與二甲基亞砜相溶（濃度為100μmol/L），保存于-20 ℃條件中，用時再用DMEM/F12 稀釋至所需濃度；DMEM/F12 培養(yǎng)基（由Hyclone 公司提供）；胎牛血清（由Gibco 公司提供）；胰蛋白酶（由Gibco 公司提供）；二甲基亞砜（由Thermo 公司提供）；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體（由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供）。

1.2 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)將U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)集中，放置于37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代。

1.3 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖情況觀察采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖情況；取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于平底96孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×104/孔，培養(yǎng)24 h 后，分為A、B、C、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，B、C、D三組分別加入200 μL 含20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養(yǎng)基，四組作用24 h、48 h、72 h 后棄上清，采用MTT 還原法，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長檢測吸光度，以其中不含細(xì)胞的空白孔進(jìn)行調(diào)零。

1.4 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況觀察（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，接種于有無菌玻片的24孔板中，細(xì)胞數(shù)為5×105/孔，培養(yǎng)24 h 后，分為A、B、C、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，B、C、D 三組分別加入 200 μL 含 20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h；取上清，將上清與包被液按照1∶1 混勻，加入96 孔酶標(biāo)板中，放置于4 ℃條件下過夜；之后在37 ℃條件下封閉1.5 h，分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體（均按照1∶1 000稀釋），放置于4 ℃條件下過夜；之后加入二抗（按照1∶1 000 稀釋），在室溫下孵育1.5 h，二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）避光顯色，當(dāng)顏色發(fā)生改變時，停止顯色，在酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測吸光度值。

（2）免疫組化法：細(xì)胞培養(yǎng)、分組、干預(yù)方法與ELISA法相同；U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，吸出上清，用10%甲醛固定細(xì)胞30 min，室溫下干燥；用內(nèi)源性過氧化物酶滅活；四組分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體（均按照1∶1 000稀釋），放置于4 ℃條件下過夜，之后滴加試劑1，放置于37 ℃條件下20 min，滴加試劑2，放置于37 ℃條件下30 min，DAB避光顯色，之后用蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。將片子放置于顯微鏡下觀察，Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細(xì)胞為胞質(zhì)中黃色或棕褐色顆粒呈彌漫性分布；記錄Bcl-2、Bax、Caspase-3 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞表達(dá)率＝（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞周期觀察取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，按1×106接種于培養(yǎng)瓶中（T25），培養(yǎng)24 h 后，分為A、D 組，A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，D 組加入200 μL 含 100 μmol/L 白消安的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后，用胰酶消化后，80%冷甲醇固定，過夜，用Annexin V/PI染色，采用流式細(xì)胞分析儀檢測兩組細(xì)胞周期。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法本研究用SPSS 19.0 軟件處理，計量資料采用xˉ±s表示，符合正態(tài)分布計量資料，一般多組間比較采用單因素方差分析，多時點觀測資料的比較采用重復(fù)測量方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法；計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗的方法，當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較培養(yǎng)24 h 后，四組U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)48 h、72 h 后，B、C、D 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度低于A組（P＜0.05），且B、C、D 組 U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞大小明顯小于 A 組；培養(yǎng)48 h、72 h后，B、C、D組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1；代表性圖片見圖1。

2.2四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況比較C 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細(xì)胞表達(dá)率高于A、B 組（P＜0.05）；D 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細(xì)胞表達(dá)率高于A、B組（P＜0.05）。見表2。

表1 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較/xˉ±s

圖1 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞代表性圖片（標(biāo)尺＝100 μm，中心細(xì)胞×100，右上角特寫×400）：A～D分別為A、B、C、D組

2.3兩組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞周期比較A 組、D 組處于G1 期細(xì)胞分別占8.20%、3.22%，處于G2/M 期細(xì)胞分別占16.07%、12.18%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組、D組處于G0/G1期細(xì)胞分別占52.27%、58.85%，處于S 期細(xì)胞分別占23.36%、25.75%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤為惡性程度較高的一種原發(fā)性腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的45%［4］。根據(jù)膠質(zhì)瘤的病理及免疫組化，可分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤［5］。研究發(fā)現(xiàn)，致癌基因高表達(dá)、抑癌基因失活、細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)，均可影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展［6］。因此，相關(guān)致癌基因及其病理機(jī)制的研究在膠質(zhì)瘤的診治中具有重要的意義，成為膠質(zhì)瘤研究熱點。

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，促進(jìn)學(xué)者了解腫瘤發(fā)生機(jī)制［7-8］，同時為探尋治療腫瘤的藥物提供依據(jù)。Ignatova等［9］首次發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，隨后大量研究證實實體膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中，存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。齊玲等［10］研究發(fā)現(xiàn)，通過分離人新鮮腦腫瘤，直接進(jìn)行培養(yǎng)，能夠獲得腦腫瘤干細(xì)胞；而該類細(xì)胞的存在，可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)的原因。雖然膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤實質(zhì)中占的比例較低，但是在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥中起著關(guān)鍵作用［11-12］。

表2 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況比較/xˉ±s

目前，學(xué)者分離培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞主要有兩種方法：（1）利用流式細(xì)胞儀或者免疫磁珠篩選CD133陽性細(xì)胞或ABCG2陽性細(xì)胞，得到含量較高的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；（2）用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，采用非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡，而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的特性，進(jìn)行膠質(zhì)瘤干細(xì)胞篩選［13-14］。

白消安為一種甲烷磺酸類的雙功能烷化劑，研究表明，白消安具有清除骨髓作用，但目前尚無證據(jù)證實白消安對成熟的淋巴細(xì)胞有殺傷作用，因此，有學(xué)者認(rèn)為，在進(jìn)行干細(xì)胞移植治療血液疾病時，可采用白消安聯(lián)合環(huán)磷酰胺進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植預(yù)處理；若環(huán)磷酰胺劑量不足時，可引起早期移植排斥，而白消安劑量不足時，可引起晚期移植排斥［15-17］。李程程等［18］研究發(fā)現(xiàn)，白消安可降低機(jī)體外周血白細(xì)胞數(shù)目，同時降低造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞的比例及數(shù)目，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷，建立造血干細(xì)胞損傷模型，為探尋造血干細(xì)胞損傷機(jī)制提供基礎(chǔ)。

本次研究發(fā)現(xiàn)，高濃度白消安可抑制U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。Caspase-3為凋亡過程中關(guān)鍵蛋白酶之一，起著重要的樞紐作用；是凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶，起著重要樞紐作用；Bcl-2 在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色，其高表達(dá)，可抑制細(xì)胞凋亡；Bax在細(xì)胞凋亡過程中的作用與Bcl-2相反，二者產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活，通過計算Bax/Bcl-2 值，可了解細(xì)胞生存狀況［19-20］。本次研究結(jié)果顯示，B、C、D 組細(xì)胞吸光度低于A 組，Caspase-3、Bax、Bcl-2 的吸光度值及陽性表達(dá)率升高，G1 期、G2/M 期細(xì)胞所比例較高；結(jié)果說明白消安可抑制U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，機(jī)制可能與白消安上調(diào)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。