歸芪活血膠囊對(duì)頸椎病模型大鼠軟骨細(xì)胞的影響

程國(guó)良 姜艷玲 李冰冰

摘要 目的：研究歸芪活血膠囊對(duì)頸椎病模型大鼠軟骨細(xì)胞白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）及MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路的影響。方法：選取60只SD級(jí)大鼠作為研究對(duì)象，將其以隨機(jī)抽簽法等分成假手術(shù)組、模型組、歸芪活血膠囊組。其中模型組與歸芪活血膠囊組參考頸椎間盤退變模型，假手術(shù)組僅切開皮膚，隨后縫合。模型組不予以任何干預(yù)，歸芪活血膠囊組則予以歸芪活血膠囊灌胃治療。干預(yù)4周后，通過甲苯胺藍(lán)實(shí)施組織染色，以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)軟骨細(xì)胞IL-6、IL-8含量，同時(shí)以Weatern Blot法檢測(cè)MKK3/6以及p38MAPK表達(dá)水平。結(jié)果：假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞IL-6水平、IL-8水平均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞MKK3/6水平、p38MAPK水平相較于模型組明顯更低（均P<0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得：頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。結(jié)論：歸芪活血膠囊的應(yīng)用可顯著降低頸椎病模型大鼠軟骨細(xì)胞IL-6、IL-8含量，同時(shí)可下調(diào)軟骨細(xì)胞MKK3/6以及p38MAPK蛋白表達(dá)水平，其主要機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路，進(jìn)一步下調(diào)IL-6、IL-8含量，從而達(dá)到治療頸椎病的目的。

關(guān)鍵詞 頸椎病;歸芪活血膠囊;白細(xì)胞介素-6;白細(xì)胞介素-8;MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路

Abstract Objective：To study the effects of Guiqi Huoxue Capsule on interleukin-6（IL-6），interleukin-8（IL-8）and mkk3/6-p38mapk signaling pathway in cervical spondylosis model rats.Methods：A total of 60 SD rats were selected as the research objects，and they were randomly divided into a sham operation group，a model group and a Guiqi huoxue Capsule group.The model group and the Guiqi Huoxue Capsule group referred to the cervical disc degeneration model，while the sham operation group only cut the skin and sutured it afterwards.The model group was not given any intervention，while the Guiqi huoxue Capsule group was given gavage to the treatment group.After 4 weeks of intervention，tissues were stained with toluidine blue，and IL-6 and IL-8 contents in chondrocytes were detected by immunohistochemistry，and mkk3/6 and p38MAPK expression levels were detected by Weatern Blot.Results：The IL-6 levels of cervical intervertebral disc chondrocytes in the sham operation group and the Guiqi Huoxue Capsule group were which were significantly lower than those in the model group，with significant differences（P<0.05）.The levels of MKK3/6 and p38MAPK of chondrocytes in cervical intervertebral discs of rats in the sham operation group and Guiqi Huoxue Capsule group were significantly lower than those in the model group（both P<0.05）.Pearson correlation analysis showed that the levels of IL-6 and IL-8 in cartilage tissue of cervical spondylosis model rats were significantly different from the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK（all P<0.05）.Conclusion：The application of Guiqi Huoxue Capsule can significantly reduce the contents of IL-6 and IL-8 in chondrocytes of cervical spondylosis model rats，and down-regulate the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK protein in chondrocytes.The main mechanism may be to further down-regulate the contents of IL-6 and IL-8 by regulating the MKK3/6-p38mapk signaling pathway，so as to achieve the purpose of treating cervical spondylosis.

Keywords Cervical spondylosis; Guiqi huoxue Capsule; Interleukin-6; Interleukin-8; Mkk3/6-p38MAPK signaling pathway

中圖分類號(hào)：R681.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.003

隨著人們生活方式以及工作形式的不斷改變，頸椎病的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢(shì)，椎間盤退變是頸椎病主要的病理基礎(chǔ)，且會(huì)累及周圍軟組織、脊髓神經(jīng)根以及血管[1]。有相關(guān)研究報(bào)道顯示，炎性細(xì)胞因子參與了椎間盤退變過程，其主要機(jī)制可能與軟骨終板破壞有關(guān)[2]。另有相關(guān)研究報(bào)道表明，在椎間盤退變后，對(duì)患者眾多炎性細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[3]，白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）分泌呈增多現(xiàn)象。因此積極減少炎性反應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，早期對(duì)軟骨細(xì)胞的炎性反應(yīng)進(jìn)行有效抑制，延緩炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致的軟骨終板退變，對(duì)椎間盤突變的防治具有極其重要的意義，應(yīng)予以重視。目前臨床上治療頸椎病包括手術(shù)治療以及保守治療，前者本身存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性，且術(shù)后易出現(xiàn)一系列并發(fā)癥，不利于推廣普及。后者相較于前者而言，更易被患者所接納，尤其是中草藥治療具有不良反應(yīng)少、經(jīng)濟(jì)成本低、舒適性較高以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[4]。鑒于此，本文通過研究歸芪活血膠囊導(dǎo)致頸椎病模型大鼠軟骨細(xì)胞IL-6、IL-8及MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路的變化，旨在為歸芪活血膠囊應(yīng)用于頸椎病的治療中提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只SD級(jí)大鼠作為研究對(duì)象，大鼠均購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，均為清潔級(jí)，體質(zhì)量為230～270 g，均實(shí)施單籠飼養(yǎng)，自由飲水，控制室溫在24 ℃左右。

1.1.2 藥物 歸芪活血膠囊（魯南厚普制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090686），藥物主要成分：黃芪、當(dāng)歸、白芍、制何首烏、枸杞子、槲寄生、鹿茸、骨碎補(bǔ)、威靈仙、透骨草、人工麝香、葛根、川芎等。

1.1.3 試劑與儀器光學(xué)顯微鏡（上海普赫光電公司，Pooher型）;RM2235切片機(jī)（萊卡公司，德國(guó)，型號(hào)：RM2235型）;石蠟包埋機(jī)（亞光醫(yī)用公司，型號(hào)：YB-9LF）;FlexiFprce ELF System（Tekscan公司，美國(guó)，型號(hào)：FlexiFprce ELF）;超低溫冰箱（SANYO公司，日本，型號(hào)：MDF-C8V）;低溫高速離心機(jī)（Beckman公司，美國(guó)，型號(hào)：Microfuge22R）;Images Advanced 6.0醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)（麥克奧迪公司，加拿大，型號(hào)：Motic Med6.0）;10%水合氯醛、無水乙醇、枸櫞酸緩沖液、蘇木精染液、冰醋酸、甲苯胺藍(lán)、麗春紅染色液（Bellman.TECH公司，美國(guó)，貨號(hào)：150245、163473、119248、102433、141681、162059、138230）;磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國(guó)，貨號(hào)：018023）;PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)，貨號(hào)：019004）;IL-6、IL-8免疫組化SP試劑盒（BIO-RAD公司，美國(guó)，批號(hào)：018244、018631）;免疫印跡一抗（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：019102）;BCA蛋白定量盒、RIPA裂解液、二抗、TBS以及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotim TECH公司，美國(guó)，貨號(hào)：020144、017348、019409、020102、018317）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將上述60只SD級(jí)大鼠以隨機(jī)抽簽法分成假手術(shù)組、模型組、歸芪活血膠囊組，每組20只。首先對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，嚴(yán)格按照體質(zhì)量予以腹腔注射麻醉藥，確保大鼠充分麻醉。將麻醉后的大鼠固定于固定板上，要求大鼠的腹部和固定板緊貼，四肢粉筆固定在兩側(cè)，背部朝上。對(duì)其頸后部位的毛發(fā)進(jìn)行剪除處理，通過碘伏消毒后，以手術(shù)刀在大鼠頸背部后正中線位置縱向切開皮膚，切口長(zhǎng)度2.5 cm。假手術(shù)組大鼠手術(shù)切開后即常規(guī)止血縫合。模型組和歸芪活血膠囊組借助血管鉗等器材，逐層鈍性分離肌肉，切斷頸部淺層與深層肌肉組織。術(shù)后予以常規(guī)止血、縫合處理，觀察組大鼠情況，并繼續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組大鼠每日定點(diǎn)予以固定處理，但不予以其他手段干預(yù)。模型組大鼠造模成功后不予以任何干預(yù)。歸芪活血膠囊組大鼠在造模成功后實(shí)施歸芪活血膠囊灌胃干預(yù)，使用劑量為1粒/次，3次/d，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 標(biāo)本采集 分別稱重大鼠，予以致死量腹腔麻醉，確定大鼠麻醉到位后，于低溫條件下進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作。保留大鼠樞椎，實(shí)施枕骨后的斷頭處理。用手術(shù)刀順著大鼠頸后部正中線縱向切開皮膚，鈍性分離各層肌肉和軟組織，取下C2～7頸椎骨，手術(shù)過程中務(wù)必保證椎間盤以及軟骨完整性。采用PBS液體清洗干凈取下的組織，用4%多聚甲醛將部分椎間盤組織固定1～2 d，用于免疫組化檢測(cè)。剩下的組織用液氮保溫瓶冷凍，并盡快置于-80 ℃冰箱保存，用于Western Blot檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)檢測(cè)IL-6、IL-8的含量 具體方法：對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片、脫蠟、水化處理，以超純水反復(fù)沖洗，并以PBS液重復(fù)沖洗3次，3 min/次。予以抗原修復(fù)、染色以及觀察。

1.3.2 采用Western Blot檢測(cè)MKK3/6、p38MAPK表達(dá)水平 具體方法：首先將組織用液氮冷凍，然后稱重并迅速放入勻漿器皿內(nèi)，加入定量的液氮研磨組織至粉末為止。滴加60 μL/mg預(yù)冷含PMSF的蛋白裂解液，確保椎間盤組織充分裂解。重復(fù)碾磨組織，反復(fù)數(shù)次，間隔2 min/次。然后將研磨組織放置于冰上裂解30 min，在蛋白被充分裂解后，將裂解完成的組織置入做好標(biāo)記的離心管內(nèi)于4 ℃溫度下離心，離心條件為1 200 r/min，時(shí)長(zhǎng)5 min，取上清液，分裝于EP管內(nèi)，保存在-80 ℃冰箱中。取96孔板分別加入相應(yīng)試劑，振蕩30 s后，放置在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，進(jìn)行比色測(cè)定。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模處理，并依次加入一抗、二抗，顯影后進(jìn)行圖像分析。通過成像分析儀進(jìn)行測(cè)定，并以目標(biāo)帶與Graph條帶灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達(dá)水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞IL-6、IL-8水平比較 假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞IL-6及IL-8水平均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.2 3組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞MKK3/6以及p38MAPK表達(dá)水平比較 假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞MKK3/6及p38MAPK水平相較于模型組均明顯更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3.3 頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達(dá)水平的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，頸椎病模型大鼠軟骨組織IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表達(dá)水平均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，頸椎病當(dāng)屬“眩暈”“痹癥”范疇，其主要發(fā)病機(jī)制為肝腎內(nèi)窺，其標(biāo)為風(fēng)、寒、濕痹著，病位于筋骨[5-7]。中醫(yī)對(duì)頸椎病癥候診斷標(biāo)準(zhǔn)囊括下述4個(gè)類型：氣滯血瘀證：受外傷或（和）損傷導(dǎo)致頸椎病證，其表現(xiàn)為痛點(diǎn)固定，多見夜間加重，伴有肢體麻木，舌紫暗，脈澀等。風(fēng)寒阻絡(luò)證：由風(fēng)寒濕邪導(dǎo)致的頸椎病證，表現(xiàn)為頸項(xiàng)疼痛、活動(dòng)不利、肢端麻木舌淡苔薄脈沉遲等癥狀。肝陽上亢證：表現(xiàn)為頸部疼痛麻木不適，伴頭痛目赤，急躁易怒，便秘，舌紅苔黃，脈弦等癥狀[8-10]。氣血不足證：由氣血不足導(dǎo)致的病證，表現(xiàn)為脹痛沉重，伴眩暈膝軟，無力疲憊，舌淡苔白脈無力等。歸芪活血膠囊具有益氣補(bǔ)腎、活血通路的作用，可治療因身體虛弱、煩勞、經(jīng)常伏案工作以及外傷、先天畸形等因素導(dǎo)致的頸椎病[11-13]，然而關(guān)于其具體作用機(jī)制尚且進(jìn)一步從細(xì)胞、分子生物水平上進(jìn)行研究。

IL-6和椎間盤基質(zhì)降解酶存在密切相關(guān)，IL-6可能正是通過酶的活性被抑制途徑發(fā)揮的致炎作用，其中IL-6可影響其他致炎物質(zhì)的釋放，且在局部炎性反應(yīng)過程中，IL-6可增強(qiáng)局部反應(yīng)[14-15]，因此IL-6可能會(huì)促進(jìn)椎間盤退變的進(jìn)程。IL-8作為炎性反應(yīng)促進(jìn)因子之一，其可在炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集過程發(fā)揮進(jìn)行性刺激作用，同時(shí)可激活以及促進(jìn)炎性反應(yīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)一步加速了椎間盤中的炎性反應(yīng)，促進(jìn)了病情進(jìn)展[16-17]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞IL-6、IL-8水平均顯著低于模型組（均P<0.05）。這在杜偉等人的研究中得到證實(shí)[18]：IL-6具有促炎以及抗炎的雙作用，可在一定程度上影響椎間盤退變，且表達(dá)水平和椎間盤退變呈正相關(guān)趨勢(shì)。同時(shí)董振風(fēng)等人采用放免法測(cè)量IL-8以及TNF的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)[19]：在椎間盤退變中，于突變?cè)缙陔A段上述2種炎性因子的含量較低，而隨著突出程度的加劇，其含量顯著增加。分析原因，筆者認(rèn)為IL-6可通過刺激炎性反應(yīng)細(xì)胞的聚集，促進(jìn)炎性反應(yīng)遞質(zhì)合成，進(jìn)一步介導(dǎo)了椎間盤退變的過程。而IL-8可大量合成MMP-3，繼而引起巨噬細(xì)胞大量的聚集，加速了椎間盤退變的吸收過程，并加重了椎間盤退變的炎性反應(yīng)。因此作者推測(cè)，歸芪活血膠囊治療頸椎病的可能機(jī)制在于下調(diào)IL-6與IL-8的表達(dá)。此外在椎間盤退變過程中，突變程度的加劇和磷酸化情況均與p38MAPK信號(hào)通路存在密切相關(guān)，激活的p38MAPK信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的大量聚集，進(jìn)一步通過促進(jìn)細(xì)胞外MMPs釋放等途徑，促進(jìn)了椎間盤退變進(jìn)程[16]。另外p38MAPK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)分別為MKK3/6、P38MAPK、PAK、MLK，其中PAK、MLK的磷酸化會(huì)促進(jìn)MKK3/6的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)p38MAPK基因轉(zhuǎn)錄。而本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組、歸芪活血膠囊組大鼠頸椎間盤軟骨細(xì)胞MKK3/6、p38MAPK水平相較于模型組明顯更低（均P<0.05）。這提示了歸芪活血膠囊用于頸椎病大鼠治療中的可能機(jī)制為影響MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路。

綜上所述，歸芪活血膠囊的應(yīng)用可抑制MKK3/6-p38MAPK信號(hào)通路，繼而抑制IL-6、IL-8的表達(dá)，最終達(dá)到防治椎間盤退變的目的。

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（2020-05-15收稿 責(zé)任編輯：王楊）