補(bǔ)腎活血湯治療股骨頭壞死的作用機(jī)制研究

施樂(lè) 張超 季文輝

摘要 目的：探討補(bǔ)腎活血湯對(duì)股骨頭壞死的療效，同時(shí)觀察其對(duì)Wnt-βcatenin信號(hào)通路的影響。方法：將45只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及中藥組，每組15只。利用甲潑尼龍琥珀酸鈉制備激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型，成模后中藥組大鼠接受補(bǔ)腎活血湯灌胃，1次/d，空白組及模型組大鼠接受生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃6周，比較各組大鼠股骨形態(tài)學(xué)、骨密度、股骨頭病理學(xué)、血清鈣、磷、股骨頭組織Wnt10b、β-Catenin水平變化。結(jié)果：1）模型組大鼠股骨頭密度高低不同，股骨頭毛糙，骨小梁模糊，中藥組大鼠股骨頭骨小梁數(shù)目較模型組增多，且相對(duì)清晰，股骨頭面較模型組光滑。2）模型組及中藥組大鼠骨密度、血清鈣、磷水平、股骨頭組織Wnt10b、β-Catenin蛋白均明顯下降（P<0.05），中藥組高于模型組（P<0.05）。3）模型組大鼠股骨頭軟骨出現(xiàn)明顯病理改變;中藥組大鼠股骨頭結(jié)構(gòu)尚完整，空骨陷窩較模型組減少，軟骨細(xì)胞排列欠規(guī)則。結(jié)論：補(bǔ)腎活血湯對(duì)股骨頭壞死有保護(hù)效應(yīng)，其作用機(jī)制與Wnt-βcatenin信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 股骨頭壞死;大鼠;補(bǔ)腎活血湯;Wnt-βcatenin信號(hào)通路

Abstract Objective：To explore the therapeutic effect of Bushen Huoxue decoction on osteonecrosis of the femoral head and its effect on Wnt-β catenin signal pathway. Methods：A total of 45 SD rats were randomly divided into blank group （n=15）， model group （n=15） and traditional Chinese medicine group （n=15）. The animal model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head was made by methylprednisolone sodium succinate. the rats in the traditional Chinese medicine group were fed with Bushen Huoxue decoction once a day， and the rats in the blank group and model group were fed with normal saline for 6 weeks. The changes of femoral morphology， bone mineral density， pathology of femoral head， serum calcium， phosphorus， Wnt10b and β-Catenin in each group were compared. Results：1） the density of the femoral head of the model group was different， the femoral head was rough and the trabeculae were blurred. The number of trabeculae of the femoral head in the traditional Chinese medicine group was more than that in the model group， and it was relatively clear， and the femoral head in the traditional Chinese medicine group was smoother than that in the model group. 2） the bone mineral density （BMD）， serum calcium and phosphorus levels， Wnt10b and β-Catenin protein in femoral head tissue of rats in model group and traditional Chinese medicine group were all decreased significantly （P<0. 05）. It was higher in the traditional Chinese medicine group than that in the model group （P<0. 05）. 3） there were obvious pathological changes in the cartilage of the femoral head in the model group， the structure of the femoral head in the traditional Chinese medicine group was still intact， the empty lacunae was less than that in the model group， and the arrangement of chondrocytes was irregular. Conclusion：Bushen Huoxue decoction has protective effect on osteonecrosis of femoral head， and its mechanism is related to Wnt-β catenin signal pathway.

Keywords Necrosis of the femoral head; Rat; Bushen Huoxue Decoction; Wnt-β catenin signaling pathway

中圖分類(lèi)號(hào)：R242;R274 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.005

近年來(lái)隨著激素在臨床使用的逐漸廣泛，激素性股骨頭壞死的已然成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要發(fā)病類(lèi)型[1]，西醫(yī)多采用外科手術(shù)對(duì)其進(jìn)行治療，但昂貴的手術(shù)費(fèi)用、假體壽命有限、創(chuàng)傷大等影響了治療依從性。因此，尋求新的臨床方案具有重要意義。股骨頭壞死屬于中醫(yī)“骨痹”“骨痿”“骨蝕”“骨虛”等范疇，不同辨證思想均認(rèn)為“腎虛”“血瘀”是貫穿該病發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[2-4]，故“補(bǔ)腎活血”成為治療股骨頭壞死的主要原則。基于此，本團(tuán)隊(duì)擬用補(bǔ)腎活血湯對(duì)激素性股骨頭壞死模型大鼠進(jìn)行治療，觀察其療效的同時(shí)對(duì)其可能相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 45只SD大鼠均購(gòu)自購(gòu)買(mǎi)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXX（滬）2011-00241），所有動(dòng)物飼養(yǎng)于本院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼養(yǎng)條件：溫度（22.37±0.42）℃，濕度（50±2.5）%，以12/12 h為光暗周期。本課題方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審批通過(guò)。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎活血湯由本院中藥研究院提供，中藥組成：鹿角膠12 g、土鱉蟲(chóng)12 g、三七6 g、黃芪20 g、牛膝12 g、丹參12 g、當(dāng)歸9 g、菟絲子12 g、女貞子12 g、甘草6 g。

1.1.3 試劑與儀器 血清鈣試劑盒（上海玉蘭生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：2400451），血清磷試劑盒（上海玉蘭生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：24283721），Wnt10b一抗（愛(ài)必信上?？萍加邢薰?，貨號(hào)：abs131412），β-catenin一抗抗體（愛(ài)必信上?？萍加邢薰?，貨號(hào)：abs13800），βactin一抗抗體（愛(ài)必信上海科技有限公司，貨號(hào)：abs118937），全自動(dòng)生化儀（貝克曼庫(kù)爾特公司，美國(guó)，型號(hào)：AU5800）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 45只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及中藥組，每組15只，各組大鼠鼠齡、體質(zhì)量等一般情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。參照參考文獻(xiàn)[5-6]，對(duì)模型組及中藥組大鼠進(jìn)行腹腔注射大腸桿菌，劑量為97.92 μg/kg，24 h注射1次，共注射2次，每次之間間隔24 h。第2次腹腔注射大腸桿菌后24 h肌肉注射甲潑尼松龍琥珀酸鈉24.5 mg/kg，1次/周，連續(xù)注射6周以建立激素性股骨頭壞死模型。與此同時(shí)注射青霉素8萬(wàn)單位/只以預(yù)防感染?？瞻捉M組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，注射頻次同模型組及中藥組。隨機(jī)選取3只大鼠取股骨頭組織進(jìn)行HE染色，股骨頭組織出現(xiàn)空骨陷窩辦周?chē)撬杓?xì)胞壞死，至少出現(xiàn)1處壞死灶提示造模成功。

1.2.2 給藥方法 中藥組大鼠接受補(bǔ)腎活血湯灌胃，按照0.66 g/mL劑量，灌胃1次/d，連續(xù)灌胃6周;空白組及模型組大鼠接受等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃6周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠股骨頭X線(xiàn)情況變化 3組動(dòng)物干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)選擇3只/組，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠固定于X線(xiàn)數(shù)據(jù)采集板上，行X線(xiàn)掃描，掃描參數(shù)設(shè)置如下：40 KV，50 mAs，照射時(shí)間為50 ms，觀察股骨頭的外形、骨小梁數(shù)目變。同時(shí)檢測(cè)左側(cè)股骨干、股骨頭的密度

1.2.3.2 股骨頭HE染色 3組動(dòng)物干預(yù)結(jié)束后隨機(jī)選擇3只/組大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉斷頭處死，冰上取出股骨頭組織置于多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，隨后進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟，再將標(biāo)本置于蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，再進(jìn)行脫水透明，將已透明的切片用樹(shù)膠封固后光鏡下觀察股骨組織病理變化。

1.2.3.3 血清鈣磷水平變化 干預(yù)后取隨機(jī)選擇3只/組大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后取腹主動(dòng)脈血，充分離心后分離出上清液，采用ELISA檢測(cè)法進(jìn)行鈣、磷濃度測(cè)定，用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至適量濃度后加至反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后用PBS沖洗3次，2 min/次，隨后加入待測(cè)樣品，室溫下反應(yīng)1 h，隨后用PBS沖洗3次，2 min/次，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體，室溫下孵育1 h后洗滌。隨后與每個(gè)反應(yīng)孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，充分反應(yīng)后加入2 mol/L硫酸0.05 mL顯色，在酶標(biāo)儀中進(jìn)行顯色測(cè)定，計(jì)算出OD值，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3.4 Western Blotting檢測(cè)各組大鼠股骨組織的Wnt10b、β-Catenin蛋白變化 干預(yù)結(jié)束后各組隨機(jī)抓取3只大鼠，利用水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭處死，后冰上快速取出股骨組織，用EDTA脫鈣液對(duì)股骨標(biāo)本進(jìn)行脫鈣，按照100 mg∶ 0.5 mL裂解液的比例對(duì)樣本進(jìn)行蛋白提取，充分勻漿后室溫下靜置15 min，測(cè)定樣本總蛋白濃度后計(jì)算上樣量，進(jìn)行電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，加入Wnt10b、β-catenin及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀釋?zhuān)龠M(jìn)行生物辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測(cè)定各樣本灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。所得數(shù)據(jù)都用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）來(lái)描述，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組股骨X光線(xiàn)變化 空白組大鼠股骨頭形態(tài)正常，股骨頭呈現(xiàn)圓球形，骨密度均勻，模型組大鼠股骨頭密度高低不同，股骨頭毛糙，骨小梁模糊，中藥組大鼠股骨骨小梁數(shù)目較模型組增多，且相對(duì)清晰，股骨頭面較模型組光滑。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠骨密度比較 與空白組比較，模型組及中藥組大鼠股骨干、股骨頭骨密度均明顯下降（P<0.05），其中中藥組股骨干、股骨頭骨密度高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清鈣、磷水平變化 ELISA顯示，與空白組比較，模型組及中藥組大鼠血清鈣、磷水平均明顯下降（P<0.05），其中中藥組血清鈣、磷水平高于模型組（P<0.05）。

2.3 各組大鼠股骨頭HE病理學(xué)改變 HE染色顯示模型組大鼠股骨頭軟骨出現(xiàn)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)明顯壞死現(xiàn)象，并出現(xiàn)聚縮現(xiàn)象，排列紊亂，骨小梁數(shù)目明顯減少，空骨陷窩增多;中藥組大鼠股骨頭結(jié)構(gòu)尚完整，空骨陷窩較模型組減少，軟骨細(xì)胞排列欠規(guī)則。見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠股骨組織Wnt10b、β-Catenin蛋白變化 Western Blotting顯示模型組與中藥組大鼠股骨頭組織Wnt10b、β-Catenin蛋白較空白組下降（P<0.05），其中中藥組股骨頭組織Wnt3a、β-Catenin蛋白較模型組上調(diào)（P<0.05）。見(jiàn)圖3，表3。

3 討論

《醫(yī)學(xué)真?zhèn)鳌庋窌?shū)中描述：“氣為血之帥，血為氣之母”，氣行血行，氣滯血瘀，氣血瘀久于骨，則髖部疼痛，關(guān)節(jié)不利”;《黃帝內(nèi)經(jīng)》亦認(rèn)為：“腎為先天之本，……主骨生髓，……則新不生”，不同辨證思想均認(rèn)為“腎虛”“血瘀”是貫穿該病發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，故“補(bǔ)腎活血”成為治療股骨頭壞死的主要原則。本團(tuán)隊(duì)及國(guó)內(nèi)其他學(xué)者[8-10]認(rèn)為均在臨床上證實(shí)補(bǔ)腎活血湯確對(duì)股骨頭壞死有理想療效。方中鹿角膠為君藥，是溫補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血之良品，三七、丹參、當(dāng)歸共奏行氣活血化瘀之功，共為臣藥，牛膝菟絲子、女貞子共為佐藥，增強(qiáng)君藥的滋補(bǔ)肝腎之功，黃芪益氣，氣為血帥，氣足則血暢，土鱉蟲(chóng)破血逐瘀，續(xù)筋接骨之功效，甘草益氣和中，為使藥。整方共奏補(bǔ)腎活血化瘀之功。在研究中我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血湯可明顯增加成模大鼠股骨骨小梁數(shù)目，修復(fù)受損的股骨頭面。病理學(xué)研究亦顯示補(bǔ)腎活血湯可修復(fù)股骨頭結(jié)構(gòu)，減少空骨陷窩現(xiàn)象，促進(jìn)軟骨細(xì)胞排列規(guī)則。這充分證實(shí)了補(bǔ)腎活血湯確可明顯改善壞死股骨組織周?chē)墓┭h(huán)境，促使新生骨的生成[11-12]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的關(guān)鍵，外界對(duì)細(xì)胞的刺激信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行傳遞，以進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體的生物學(xué)行為，確保生命活動(dòng)的順利進(jìn)行[13]。Wnt/β-Catenin是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，廣泛參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、組織內(nèi)環(huán)境維持等環(huán)節(jié)[14]。Wnt家族有諸多成員，其中Wnt10b0b與骨密度和骨強(qiáng)度維持關(guān)系密切，Wnt10b0b的表達(dá)強(qiáng)弱可直接調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性的能力，從而維持成人骨骼中成骨祖細(xì)胞的數(shù)量，刺激成骨細(xì)胞礦化活性增強(qiáng)[15-17]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組與中藥組大鼠股骨頭組織Wnt10b、β-Catenin蛋白較空白組下降，經(jīng)過(guò)補(bǔ)腎活血湯干預(yù)后大鼠股骨頭組織Wnt10b、β-Catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明了補(bǔ)腎活血湯介導(dǎo)股骨頭壞死的治療與Wnt-βcatenin信號(hào)通路。

總之，補(bǔ)腎活血湯對(duì)股骨頭壞死大鼠股骨頭有保護(hù)效應(yīng)，其作用機(jī)制與Wnt-βcatenin信號(hào)通路有關(guān)。

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（2019-08-30收稿 責(zé)任編輯：徐穎）