黃嘌呤氧化還原酶與慢性腎臟病患者腎損害的關(guān)系研究

張譯元 趙明月 韋娟余 張帥 許蒙 鄭東輝

223002 淮安，江蘇省徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院腎臟內(nèi)科

黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)是一種復(fù)雜的含鉬蛋白質(zhì)聚合物，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)100多年[1]，在哺乳動(dòng)物中，XOR主要催化嘌呤降解的末端反應(yīng)，其在人體內(nèi)有兩種不同存在形式：黃嘌呤氧化脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)[2]。在生理?xiàng)l件下，XDH將電子轉(zhuǎn)移至氧化狀態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)(NADH)，同時(shí)生成尿酸(uric acid，UA)，而XO形式利用氧氣生成UA的同時(shí)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[3]，因此血漿XOR活性表示兩種存在形式的總活性[4]。在病理情況下(低氧、炎癥及組織損傷等)，血漿中XOR活性增強(qiáng)，ROS生成速率增加，促進(jìn)內(nèi)皮損害發(fā)生和發(fā)展[5]。有研究指出，XOR在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ROS具有損害內(nèi)皮細(xì)胞功能并激活炎性小體的作用[6]。

慢性腎臟病(chronic kidoney diease,CKD)是指各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)或功能損害>3個(gè)月。既往研究指出，腎臟作為高代謝類器官，極易受到ROS的損害[7]。當(dāng)人體內(nèi)ROS和抗氧化防御系統(tǒng)失衡時(shí)，將導(dǎo)致ROS不能被充分降解，未降解而蓄積的ROS則會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)組織和器官的損傷[8]，同時(shí)會(huì)促進(jìn)CKD病程的進(jìn)展甚至誘發(fā)心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)[9]。ROS有多種來源途徑，XOR是其重要來源之一[10]。目前已證實(shí)XOR抑制劑通過抑制UA的生成來保護(hù)腎組織[11]，然而矛盾的是，嘌呤代謝產(chǎn)生的UA在非高尿酸血癥的患者體內(nèi)主要發(fā)揮抗氧化作用[1]，只有超過血液溶解能力形成UA晶體時(shí)才起氧化作用。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)UA正常CKD患者血中XOR、XO活性和XO/XOR比值進(jìn)行探究，具體如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年9月至2019年10月期間于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院腎內(nèi)科就診的105例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者皆符合2012年KDIGO指南確診為CKD。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性腎功能不全、嚴(yán)重肝功能異常者；(2)近一周內(nèi)使用降尿酸藥物(別嘌呤醇，非布司他，托比司他等)、抗氧化劑(維生素C等)、類固醇類激素、抗病毒藥物和磺脲類降糖藥物者；(3)近一個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑、干擾素和苯妥英鈉等患者；(4)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良患者,惡性腫瘤患者,孕婦和哺乳者。本研究獲得患者及家屬的同意，且經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意。

二、資料收集方法

1.血漿XOR含量測(cè)定 利用XOR可催化黃嘌呤生成UA的特性，在標(biāo)本中加入黃嘌呤后催化反應(yīng)，令其充分被XOR氧化分解，后根據(jù)其產(chǎn)生UA的含量來計(jì)算酶的活性。本實(shí)驗(yàn)將XOR活性的單位定義為37 ℃下每升樣本中每分鐘分解黃嘌呤產(chǎn)生1 μmol UA為一個(gè)酶活性單位(U/L)。

2.血漿XO活性測(cè)定 利用高靈敏度熒光法檢測(cè)，其中活性XO可催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，同時(shí)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，并且在電子受體及顯色劑存在的情況下，生成紫紅色結(jié)合物，根據(jù)后者含量可以推算出活性XO的含量。

3.其他臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)收集 收集所有患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)等一般資料，所有患者空腹條件下的血漿統(tǒng)一送至徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院檢驗(yàn)科，檢測(cè)其血肌酐(Scr)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(Alb)、血清尿素氮(BUN)、UA、總膽固醇(total cholesterol，TCHO)、三酰甘油(triglyceride，TG)、血鉀、血鈣、血磷等指標(biāo)，并根據(jù)患者Scr水平計(jì)算估算腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)，采用MDRD評(píng)估公式：eGFR=186×[血清肌酐]-1.154×[年齡]-0.203×0.742(女性)；eGFR=186×[血清肌酐]-1.154×[年齡]-0.203×1(男性)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、臨床資料

本研究供納入105例患者，其中男60例，女45例，年齡(67.2±14.8)歲，患者臨床資料如表1。

表1 患者臨床特征

二、患者的血漿XOR、XO活性及XO/XOR比值與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者血漿XOR活性與eGFR、DBP、FBG、GGT呈正相關(guān)(rS分別為0.307、0.270、0.341、0.234)，與年齡、血氯呈負(fù)相關(guān)(rS分別為-0.197、-0.234)(均P<0.05)；患者血漿XO活性與FBG、GGT、TBil、TG呈正相關(guān)(rS為0.377、0.281、0.196、0.246)，與血氯呈負(fù)相關(guān)(rS為-0.252)(均P<0.05)；XO/XOR比值與年齡、BUN呈正相關(guān)(rS分別為0.194、0.197)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(rS為-0.327)(均P<0.05)。(表2)

表2 患者XOR、XO、XO/XOR與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

三、患者XOR、XO活性和XO/XOR比值的多重線性回歸分析

分別以XOR、XO和XO/XOR比值為因變量，以存在相關(guān)性的指標(biāo)為自變量，建立多元線性逐步回歸模型，結(jié)果顯示，eGFR、FBG、DBP為XOR的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，F(xiàn)BG、GGT為血漿XO活性獨(dú)立影響因素(P<0.05)，eGFR為血漿XO/XOR比值的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。(表3)

表3 血漿XOR、XO活性及XO/XOR比值的影響因素

四、不同eGFR水平患者的XOR、XO活性和XO/XOR比值比較

將患者分為eGFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1與eGFR≥60 mL·min-1·(1.73 m2)-1組，比較兩組患者的XOR、XO活性和XO/XOR比值，結(jié)果顯示，兩組患者的XOR活性、XO/XOR比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組XO活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表4)

表4 不同eGFR水平患者的XOR、XO活性和XO/XOR比值比較

討 論

從全球來看，CKD患病率約為8%～16%，并呈逐年上升的趨勢(shì)，數(shù)據(jù)顯示，1990年至2010年間，在全球死亡病因的排名上CKD從原本的第27位上升至第18位，且上升速度僅次于艾滋病[12]。就我國(guó)而言，CKD的患病率高達(dá)10.8%，并且每100萬人口中就有1 000～1 500人正在接受血液透析治療。ROS的蓄積會(huì)加重人體組織器官的損害[13]，促進(jìn)CKD患者病程進(jìn)展。而XOR是血管內(nèi)ROS的主要來源之一，在人體中小腸和肝臟中含量最高[14]。正常的生理情況下，血漿中的XOR主要以XDH形式存在，只有在氧化應(yīng)激以及組織損傷等病理情況下，XDH被蛋白酶修剪使其永久地轉(zhuǎn)化為XO形式[4]，而CKD患者血漿中炎性小體的激活[15]，為XDH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造了有利條件，XO形式是XOR產(chǎn)生ROS的主要形式[16]，這一結(jié)構(gòu)的改變促進(jìn)ROS生成速率[17]，一方面產(chǎn)生的ROS可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，加快CKD病程[18]，另一方面其可進(jìn)一步激活炎性小體，損傷腎臟內(nèi)皮[11]以及腎小球?yàn)V過屏障，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化等[19]，最終使患者進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的透析階段[20-21]。因此，降低CKD患者血漿XOR活性以及抑制其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可延緩病程。

本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，CKD患者血漿XOR活性與eGFR、DBP、FBG、GGT、年齡、血氯存在相關(guān)性(P<0.05)，而Furuhashi等[22]研究結(jié)果顯示XOR與AST、ALT相關(guān)，并且未顯示出XOR與腎功能存在相關(guān)性，分析結(jié)果不完全相同的原因在于：(1)本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，可能存在相關(guān)性因素未顯現(xiàn)出；(2)樣本選擇的不同，本研究針對(duì)CKD患者，而Furuhashi研究皆為健康人群。進(jìn)一步以XOR活性、XO活性、XO/XOR比值為因變量，以存在相關(guān)性的臨床資料作為自變量，建立多元線性(逐步)回歸模型，結(jié)果顯示，eGFR、FBG、DBP為XOR的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，F(xiàn)BG、GGT為血漿XO活性獨(dú)立影響因素(P<0.05)，這與Terawaki等[23]研究大致相同。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，控制患者FBG、DBP水平有利于抑制XOR活性，進(jìn)而延緩CKD病程的作用。然而與我們預(yù)測(cè)不同的是：我們發(fā)現(xiàn)隨著eGFR的下降，XOR活性也隨之下降。查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，eGFR降低時(shí)腎臟內(nèi)皮功能降低，而血漿XOR活性可反映內(nèi)皮細(xì)胞XOR活性，因此eGFR較低時(shí)XOR活性的降低與內(nèi)皮功能下降有關(guān)。然而本研究針對(duì)的是UA正常患者(UA<420 μmol/L)[24]，而我國(guó)XOR抑制劑(別嘌呤醇等)在抑制ROS生成的同時(shí)抑制了UA的生成[25]，有試驗(yàn)證明當(dāng)女性受試者UA<238 μmol/L時(shí)XOR活性異常增高[26]，因此進(jìn)一步研究出一種抑制XOR活性而不影響UA生成藥物可能會(huì)成為未來延緩CKD病程進(jìn)展的一種新的治療藥物。

同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)，eGFR是XO/XOR比值獨(dú)立影響因素。血漿XO/XOR比值增加，證明毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的XO/XOR比值也增加[21]，理論上講，血漿XO/XOR比值的增加表示XDH→XO結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的速率的增快，這一結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變促進(jìn)ROS生成，加快腎損害的進(jìn)展。因此我們猜測(cè)，在CKD患者中，隨著病程的進(jìn)展，XO/XOR比值的增加是導(dǎo)致eGFR下降的重要原因之一。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，入選患者中有15位患者的XO/XOR比值超過1，這可能由于XDH→XO轉(zhuǎn)化不可逆，導(dǎo)致XO/XOR比值超過1的“假象”，在這些XO/XOR比值超過1的患者中有12例患者的eGFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1，我們進(jìn)一步將患者根據(jù)eGFR分為兩組，組間比較后發(fā)現(xiàn)eGFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1組與eGFR≥60 mL·min-1·(1.73 m2)-1組相比，XOR活性較低，但XO/XOR比值卻較高，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)在eGFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1組中患者有較快的XDH→XO轉(zhuǎn)化速率，即較快的ROS生成速率，因此針對(duì)eGFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1的患者，抑制XDH→XO的轉(zhuǎn)化率可更有效的降低ROS生成速率，從而達(dá)到延緩CKD病程的作用，這也進(jìn)一步證實(shí)了XO/XOR比值和腎功能的關(guān)系，而在eGFR≥60 mL·min-1·(1.73 m2)-1的患者中，抑制XOR活性可獲得較大的延緩病情進(jìn)展的收益。

綜上所述，氧化應(yīng)激是CKD患者病程進(jìn)展、腎功能下降的主要原因，減少ROS的生成是延緩CKD患者腎損害的重要措施之一。因此控制CKD患者FBG、DBP水平有利于降低血漿XOR活性及與其相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥小體的激活等。另外本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在非高尿酸血癥患者中，隨著eGFR的下降，XO/XOR比值升高，促使ROS產(chǎn)生速率增高，ROS的快速生成加速了CKD患者病程進(jìn)展，最終不可逆的進(jìn)入透析階段，因此我們提出，CKD患者不論UA水平是否升高，抑制XO/XOR比值可以起到抑制ROS生成，而不影響UA生成的作用，所以研發(fā)一種新的藥物抑制XO/XOR比值而不影響UA生成可能成為UA正常CKD患者延緩病程進(jìn)展的重要治療策略。

本研究的局限性在于:首先，在試驗(yàn)過程中未評(píng)估腎臟內(nèi)皮功能及血管損傷程度，且臨床研究中影響XOR活性的因素較多，可能還有其他未被發(fā)現(xiàn)的影響因素。其次，本研究為橫斷面研究，臨床樣本不夠多，因此，有必要對(duì)更多的受試者群體進(jìn)行研究，以進(jìn)行更詳細(xì)且全面的統(tǒng)計(jì)分析。