[4-(2-氯-4a，10a-二氫吩噻嗪-10-基)-丁基]-三苯基-磷鎓抑制骨肉瘤細胞的機制研究*

李文靜，王 睿，方雯珺，張書文，吳 喆，孫燕玲，阮 英，高 濤，寧志豐**，劉復(fù)興**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院；3.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.湖北科技學(xué)院核化生學(xué)院)

據(jù)報道10-20歲患者約占骨肉瘤病人的60%，并且骨肉瘤是該年齡段青少年死亡的第二大主導(dǎo)原因[1]。骨肉瘤不僅復(fù)發(fā)率高，而且具有較高的侵襲和全身轉(zhuǎn)移性，近10年診斷的骨肉瘤患者中約有10%～20%發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其中90%死亡原因是肺轉(zhuǎn)移。骨肉瘤較高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)通常會導(dǎo)致預(yù)后不良，五年總生存率僅為20%～30%[2-3]，這促使研究人員尋找新的療法。

二十世紀初人們發(fā)現(xiàn)用于治療精神病的吩噻嗪類藥物有良好的抗腫瘤作用[4]。隨后進一步的研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤機制主要為通過抑制DNA依賴性蛋白激酶來誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制血管生成，還可通過抑制外排泵來增加腫瘤細胞對其他化療藥物的敏感性[5]。近年來發(fā)現(xiàn)其中的三氟拉嗪和甲硫噠嗪還可以抑制癌干細胞[6-7]。但由于這類藥物對腫瘤的選擇性不高所以還不能單獨用于臨床治療腫瘤。三苯基膦(TPP)是一種可穿過線粒體膜的親脂性陽離子，因化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有3個苯基，使得該分子具有很強的脂溶性；同時，結(jié)構(gòu)中磷原子上的正電荷可以離域到3個苯環(huán)上，形成離域正電荷，促使TPP 穿過脂質(zhì)雙分子層[8]。本實驗通過使用TPP來修飾2-氯吩噻嗪以期可以增加其對骨肉瘤的毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2-氯吩噻嗪和氯丙嗪購自湖北鴻鑫瑞宇精細化工有限公司。三苯基膦(TPP)、1，4-二溴丁烷、碘甲烷和二氯亞砜購自Macklin公司。人骨肉瘤細胞U2OS購自美國典型培養(yǎng)物典藏中心(ATCC)，胎牛血清和MTT購自Gibco公司。所有抗體均購自ABclonal公司。Dulbecco的改良Eagle's培養(yǎng)基(DMEM)和RPMI培養(yǎng)基購自HyClone公司。其它試劑均為市售分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 化合物合成

步驟一：取1，4-二溴丁烷溶于甲苯并置于100℃油浴中，待溫度升至100℃后向其中緩慢滴加溶于無水甲苯的三苯基膦溶液，邊加邊攪拌，待滴加完畢反應(yīng)24h終止反應(yīng)，過濾并用甲苯洗兩次，干燥得白色固體；其中，三苯基膦與1，4-二溴丁烷的物質(zhì)的量比值為1∶1，1，4-二溴丁烷和三苯基膦在甲苯中的初始濃度均為0.1～0.2mM，反應(yīng)式如下：

步驟二：以物質(zhì)的量比值為1∶1分別稱取步驟一所得白色固體和2-氯吩噻嗪于無水的DMF中，并加入氫化鈉密閉遮光,在氮氣保護下室溫攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)終止后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，過硅膠柱純化，即得吩噻嗪類衍生物[4-(2-氯-4a，10a-二氫吩噻嗪-10-基)-丁基]-三苯基-磷鎓即化合物a；其中，氫化鈉的摩爾量是2-氯吩噻嗪的5倍，2-氯吩噻嗪在無水DMF中的初始濃度為0.1～0.2mM，反應(yīng)式如下：

1.2.2 細胞培養(yǎng)

我們使用添加有10% FBS、100U/ml 青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在含有5%CO2的37℃恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨肉瘤U2OS細胞，待細胞密度達85%左右時予以傳代。

1.2.3 MTT檢測細胞活力

用MTT法測定細胞活力。將對數(shù)生長期的U2OS細胞(7～10×103細胞/孔)接種在96孔板中過夜，然后基于預(yù)實驗設(shè)計給藥濃度包含IC50前后至少兩個點(5-氟尿嘧啶濃度(陽性對照)0、2.5、5、7.5、10、12.5μM；化合物a：0、2.5、5、7.5、10、12.5μM。給藥后陽性對照組給藥24h，化合物a給藥12、24、36h。向每個孔中加入MTT(0.5mg/mL)。在細胞培養(yǎng)箱中孵育4h后，除去上清液，向各孔中加入150μL DMSO作為溶劑。使用Multiskan Ascent微孔板光度計(EnSpire 2300 Multilabel Reader;PerkinElmer，Inc.，Waltham，MA，USA)在490nm處測量吸光度。不給藥組(對照組)被認為具有100%的活力(由于平板克隆實驗為7d參照MTT實驗結(jié)果調(diào)小給藥濃度為：0，0.5，1，2μM，其它實驗參照MTT實驗選用給藥濃度為0，2.5，5μM給藥時間為24h)。

1.2.4 平板克隆形成實驗

將對數(shù)生長期U2OS細胞(1000個細胞/孔)接種到六孔板中過夜，然后與不同濃度的化合物a一起孵育(由于平板克隆實驗為7d參照MTT實驗結(jié)果調(diào)小給藥濃度為：0，0.5，1，2μM)。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d。最后將6孔板中的細胞浸入PBS中洗滌2次，在室溫下在甲醇中固定15min，并用吉姆薩染液染色15min。在顯微鏡下計數(shù)含有超過50個細胞的克隆數(shù)。然后根據(jù)下式計算克隆形成率：克隆形成率(%)=陽性克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.5 Transwell遷移侵襲實驗

取處于對數(shù)生長期的U2OS細胞，將其密度調(diào)節(jié)至2.5×106/mL。后將0.5～1×105個細胞接種到不含血清的200μL DMEM高糖培養(yǎng)的Transwell上室中。將含有20%血清的500μL DMEM高糖培養(yǎng)物加入Transwell下室中。設(shè)定下室化合物a的濃度為0、2.5和5μM在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，擦洗上室的內(nèi)表面，后將其在預(yù)冷的甲醇中固定20min，接著用0.1%結(jié)晶紫染色15min。最后計數(shù)遷移至小室下表面的細胞。侵襲試驗則要在Transwell小室內(nèi)表面涂布3.9μg/mL基質(zhì)膠(BD)，其他步驟與遷移試驗相同。培養(yǎng)24h后，計數(shù)侵入小室下表面的細胞。

1.2.6 凋亡和自噬實驗

取處于對數(shù)生長期的U2OS細胞，將其密度調(diào)節(jié)至1～1.5×105/mL后將100μL細胞懸液接種到96孔板中過夜后給藥，給藥濃度為0、2.5和5μM。24h后使用自壞死和凋亡檢驗試劑盒和噬試劑盒測量凋亡和自噬，并用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 16.0軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析，并使用GraphPad Prism 6.0軟件(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)做圖。結(jié)果表示為(平均值±標準差)，所有實驗重復(fù)3次。使用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，并使用最小顯著差異事后檢驗來確定統(tǒng)計學(xué)意義。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 化合物a的表征

化合物a純度≥98%其結(jié)構(gòu)表征如下：

1H NMR (400 MHz，CDCl3) ：δ 7.71-7.66 (m，5H)，7.54-7.42 (m，8H)，7.44-7.11 (ddd，J=8.4，5.2，2.2 Hz，3H)，7.19-7.00 (m，1H)，6.96-6.78 (d，5H)，3.82 (t，J = 6.6 Hz，2H)，2.28 (m，2H)，1.93 (dd，2H)，1.77 (dt，2H)(圖1，封二)。13C NMR (101 MHz，CDCl3)： δ 146.43，144.38，133.32，133.24，132.34，131.74，131.71，130.79，130.70，128.73，128.61，127.99，127.60，127.49，125.11，123.88，123.03，122.38，115.89，115.86，46.77，29.63，28.91，27.79，27.66，19.24，19.20(圖2，封二)。

2.2 MTT實驗結(jié)果

MTT實驗結(jié)果可知化合物a的IC50為(6.04±0.83)μM；5-氟尿嘧啶在12.5 μM對細胞的抑制率只有0.11%。由此可知化合物a對骨肉瘤的抑制效果遠遠優(yōu)于5-氟尿嘧啶。而且隨著化合物a的給藥濃度增加抑制作用也隨之增加；同一給藥濃度隨著給藥時間增加抑制作用也增加。由此可見化合物a可以濃度和時間依賴的抑制骨肉瘤細胞的增殖(圖3)。

A.隨著時間的延長為化合物a對腫瘤細胞的作用增加；B.化合物a對比陽性對照5-氟尿嘧啶給藥24 h對腫瘤細胞的抑制作用。*P<0.05，**P<0.01 and ***P<0.001

2.3 平板克隆形成實驗結(jié)果和Transwell遷移和侵襲結(jié)果

化合物a接下來的平板克隆形成實驗和Transwell遷移侵襲實驗結(jié)果顯示化合物a可以劑量依賴性抑制骨肉瘤細胞U2OS平板克隆形成實驗(圖4，封二)、Transwell小室遷移和侵襲實驗(圖5，封二)。

2.4 凋亡和自噬實驗

凋亡與自噬實驗結(jié)果(圖6，封二)表明化合物a可以通過誘導(dǎo)凋亡而不是自噬促使骨肉瘤U2OS細胞死亡。

3 討 論

抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程極具挑戰(zhàn)性。造成抗腫瘤藥物研發(fā)困難的原因有很多，其中之一是因為對腫瘤發(fā)病機制的了解還不夠全面，從而缺乏只針對腫瘤細胞靶向藥物。目前發(fā)現(xiàn)的常見腫瘤表型異常包括形態(tài)變化、基因表達改變、代謝改變而最常見的代謝改變就是線粒體中糖代謝的改變[9]，線粒體是細胞能量工廠參與細胞代謝及能量產(chǎn)生，以及維持鈣和氧化還原的體內(nèi)平衡[10-12]。正常細胞通過氧化磷酸化從葡萄糖中產(chǎn)生大部分ATP。線粒體通過消耗線粒體內(nèi)膜上產(chǎn)生的質(zhì)子而把電子泵送到呼吸鏈進一步產(chǎn)生ATP。另一方面，癌細胞通過糖酵解產(chǎn)生大部分ATP，并且其氧化磷酸化減少，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜的消耗較少，其內(nèi)外膜的質(zhì)子梯度升高。質(zhì)子梯度的積累可能是各種癌細胞中觀察到的線粒體膜電位升高(ΔΨm)原因之一[9，13]。

正常細胞和惡性細胞之間可檢測到的ΔΨm的差異至少為60mV。親脂性離域陽離子基團(DLCs)是由負離子電位驅(qū)動的可在線粒體中累積的化合物家族。一些具有較高的ΔΨm惡性細胞對DLC敏感，DLC可選擇性地積聚在其線粒體中[14-15]。該類分子具有疏水結(jié)構(gòu)和離域正電荷基團，這些分子特征使DLC更容易跨越脂質(zhì)膜。而線粒體中負的跨膜電勢使這些DLC更容易在線粒體中積累。然而，盡管在體外DLC能有效地預(yù)防線粒體損傷，但DLC具有的主要缺點就是電荷累積到基質(zhì)中會導(dǎo)致線粒體膜去極化引起細胞毒性[16]。DLC家族的成員結(jié)構(gòu)多樣化，而不同的結(jié)構(gòu)又使這些親脂性離域陽離子基團具有不同的線粒體靶向能力。三苯基膦(TPP)是DLC家族的成員，屬于無毒化學(xué)部分，其功能在于活細胞中的線粒體靶向信號(MTS)。所以在這項研究中，我們選擇TPP作為化學(xué)線粒體靶向信號之一，由于本實驗對氯丙嗪的抗腫瘤作用亦有涉及，基于氯丙嗪的結(jié)構(gòu)，我們選擇TPP作為氯丙嗪改造的線粒體靶向信號。

近年來有報道抗精神病藥物吩噻嗪類具有抗腫瘤作用，但由于其具有廣泛的藥理學(xué)作用導(dǎo)致其靶向性不強并由此引發(fā)一系列與治療作用無關(guān)的副作用。而未能用于臨床來治療腫瘤。為了增加藥物的靶向性本研究用二氯吩噻嗪與線粒體靶向基團相接，最后用細胞實驗驗證了改造后的藥物具有良好的抗腫瘤活性。通常，吩噻嗪的衍生物的骨架特征是具有硫氮雜蒽母核的三環(huán)與10位的氮連接的烷基側(cè)鏈構(gòu)成的一類化合物。最先發(fā)現(xiàn)的吩噻嗪類化合物是亞甲基藍，隨后有人通過加熱二苯胺和硫合成吩噻嗪骨架。目前其骨架合成方法又進行了進一步改進。以氯丙嗪為先導(dǎo)化合物，對吩噻嗪類藥物進行結(jié)構(gòu)改造。結(jié)構(gòu)改造的部位多數(shù)集中在三環(huán)上的取代基、10位N上的取代基及三環(huán)的生物電子等排體等三方面，并在結(jié)構(gòu)改造中總結(jié)出吩噻嗪類藥物的構(gòu)效關(guān)系。①苯環(huán)上取代基的影響—吩噻嗪苯環(huán)上取代基的位置和性質(zhì)與抗精神病的活性和強度都有密切關(guān)系。1、3和4位有取代基時活性均會降低，只有2位引入吸電子基團才可增強活性。當2位的氯被吸電子作用更強的三氟甲基取代時，抗精神病活性增強。苯環(huán)2位被硫取代，可以降低錐體外系副作用。②吩噻嗪10位氮原子的取代基對活性的影響—側(cè)鏈末端的取代基為含氮的堿性基團，對取代基進行結(jié)構(gòu)改造，對活性的影響很大。堿性基團常為叔胺，可為脂肪叔胺基，如二甲氨基，也可為氮雜環(huán)，常用哌啶基和哌嗪基，以哌嗪取代的側(cè)鏈作用最強。③吩噻嗪10位氮原子到側(cè)鏈氮原子的距離對活性的影響—當10位氮原子與側(cè)鏈堿性氨基之間相隔3個直鏈碳原子時作用最強，碳鏈的延長或縮短，或出現(xiàn)分支，都將導(dǎo)致抗精神病作用的減弱或消失[17]。

本文只證明吩噻嗪與線粒體靶向陽離子改造產(chǎn)物有抗腫瘤效果，并且其抗腫瘤效果與陽離子基團有關(guān)。但實驗條件有限未能證明改造后的藥物能靶向線粒體也未做動物實驗，但通過許多基礎(chǔ)實驗如MTT實驗、平板克隆形成實驗、Transwell遷移和侵襲實驗證明化合物a確實有較好的抑制骨肉瘤作用，通過進一步的凋亡和自噬實驗發(fā)現(xiàn)化合物a是通過誘導(dǎo)凋亡而不是自噬來發(fā)揮其藥效。由于吩噻嗪具有廣泛的生物活性，在癌癥研究中也具有重要作用。其可以通過幾種機制發(fā)揮抗腫瘤活性，其中最重要的是誘導(dǎo)細胞凋亡的過程，如抑制DNA修復(fù)機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]，但它們的直接DNA損傷和膜不穩(wěn)定作用也很突出[19]。并且吩噻嗪可以抑制腫瘤的多藥耐藥性增加腫瘤對化療藥物的敏感性[20]，也有相關(guān)實驗證明吩噻嗪具有抗腫瘤的血管生成[21]。但由于吩噻嗪有廣泛藥理作用，因此，其副作用也隨之增多，所以為了增加其對腫瘤的靶向性減少對正常細胞的毒性，對吩噻嗪結(jié)構(gòu)修飾和改造具有可行性。