吡草醚懸浮劑和微乳劑的高效液相色譜分析方法

原萬(wàn)玲，馬杜康，孟 璨，趙鵬躍，黃啟良（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

吡草醚（pyraflufen-ethyl），化學(xué)名2-氯-5-(4-氯-5-二氟甲氧基-1-甲基吡唑-3-基)-4-氟苯氧基乙酸乙酯，商品名速草靈、丹妙藥、吡氟苯草酯等，由日本Nohyaku公司開(kāi)發(fā)，是一種新型的苯基吡唑類苗后觸殺型除草劑，其作用機(jī)理是抑制植物體內(nèi)的原卟啉Ⅳ氧化酶，利用小麥與雜草對(duì)藥劑吸收和代謝的差異，達(dá)到選擇性地防治小麥田闊葉雜草的效果[1-2]，也可有效促使成熟期的棉花脫葉[3]。2013年國(guó)內(nèi)企業(yè)首次登記吡草醚產(chǎn)品。目前，我國(guó)登記的含有吡草醚有效成分的農(nóng)藥產(chǎn)品共9個(gè)，其中原藥3個(gè)，母藥1個(gè)，懸浮劑3個(gè)，微乳劑2個(gè)，應(yīng)用于棉花和小麥田。然而，吡草醚農(nóng)藥產(chǎn)品尚無(wú)國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不能依法進(jìn)行檢驗(yàn)檢測(cè)。因此，開(kāi)展吡草醚農(nóng)藥產(chǎn)品中有效成分測(cè)定通用分析方法的研究，可以加快制定標(biāo)準(zhǔn)的步伐，盡早解決依法檢驗(yàn)檢測(cè)和依法監(jiān)督管理問(wèn)題。

有文獻(xiàn)報(bào)道了以鄰苯二甲酸二環(huán)己酯為內(nèi)標(biāo)物，利用氣相色譜分析吡草醚原藥的方法，該方法具有較好的線性、精密度和準(zhǔn)確度[4]。劉同金等[5]采用氣相色譜建立了吡草醚在小麥及土壤中的殘留分析方法。秦旭等[6]采用高效液相色譜法測(cè)定了棉花中吡草醚的殘留。張煜卓等[7]采用QuEChERS技術(shù)與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了南國(guó)梨中吡草醚的殘留。目前關(guān)于吡草醚制劑產(chǎn)品的分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了在同一液相條件下測(cè)定吡草醚懸浮劑和微乳劑的方法，為吡草醚農(nóng)藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-DAD高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器），Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；有機(jī)過(guò)濾器（微膜孔徑0.45 μm）。

乙腈（色譜純）；二次蒸餾水；吡草醚標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.97%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；2%吡草醚懸浮劑，山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司；2%吡草醚微乳劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司。

1.2 液相色譜操作條件

流動(dòng)相：乙腈+水（體積比65∶35）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：243 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；保留時(shí)間：吡草醚約9.5 min。

上述液相色譜操作條件是典型的操作參數(shù)，可以根據(jù)不同儀器特點(diǎn)和溫度條件，對(duì)給定的操作參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最佳效果。典型的吡草醚標(biāo)準(zhǔn)品、2%吡草醚懸浮劑、2%吡草醚微乳劑樣品高效液相色譜圖見(jiàn)圖1、2、3。

圖1 吡草醚標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖2 2%吡草醚懸浮劑高效液相色譜圖

圖3 2%吡草醚微乳劑高效液相色譜圖

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

稱取0.025 g（精確至0.000 01 g）吡草醚標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，記為標(biāo)樣溶液。

1.3.2 試樣溶液的配制

分別稱取2%吡草醚懸浮劑和2%吡草醚微乳劑試樣0.3 g（精確至0.000 01 g）于100 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾待測(cè)。

1.3.3 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針吡草醚峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 計(jì)算

將測(cè)得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中吡草醚峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中吡草醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)w（%）按式（1）計(jì)算：

式中：w為試樣中吡草醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A2為試樣溶液中吡草醚峰面積的平均值，mAU·s；m1為吡草醚標(biāo)樣的質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中吡草醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中吡草醚峰面積的平均值，mAU·s；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于2%吡草醚微乳劑中干擾較大，為使有效成分得到良好的分離效果，并且分析時(shí)間相對(duì)合適，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，根據(jù)吡草醚的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對(duì)不同配比的乙腈和水、甲醇和水流動(dòng)相進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈＋水（體積比65∶35），流速為1.0 mL/min,吡草醚保留時(shí)間為9.5 min，能夠獲得良好的分離效果。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器對(duì)吡草醚溶液在225～380 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。吡草醚的紫外光譜圖如圖4所示。從圖4中可見(jiàn)，吡草醚的最大吸收波長(zhǎng)約為243 nm，在該波長(zhǎng)處?kù)`敏度較高，各種雜質(zhì)不影響吡草醚的測(cè)定，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為243 nm。

圖4 吡草醚紫外吸收譜圖

2.3 分析方法的特異性

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別吡草醚。吡草醚標(biāo)樣、2%吡草醚懸浮劑、2%吡草醚微乳劑中的吡草醚HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的線性關(guān)系

按1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制方法配制標(biāo)樣溶液，用甲醇以1∶1的比例梯度稀釋四次，獲得5個(gè)濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。待儀器穩(wěn)定后，在上述操作條件下，按照分別進(jìn)同樣體積的標(biāo)樣，進(jìn)行測(cè)定，取兩次測(cè)定的平均結(jié)果。以吡草醚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖5可以看出，當(dāng)吡草醚質(zhì)量濃度在15.75 mg/L～251.92 mg/L之間（進(jìn)樣體積5 μL），與相應(yīng)的吡草醚峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=8.732 8 x＋9.456 2，相關(guān)系R2=0.999 9，完全可以滿足定量分析要求。

圖5 吡草醚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 分析方法的精密度

從同一樣品中稱取5個(gè)試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得2%吡草醚懸浮劑和2%吡草醚微乳劑的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.07%和0.01%（表1）。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2%吡草醚微乳劑中吡草醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為0.59，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.43（其中C為樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

2%吡草醚懸浮劑中吡草醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為0.73，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.42，表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

2.6 分析方法的準(zhǔn)確度

分別稱取5個(gè)已知含量的懸浮劑和微乳劑試樣于100 mL容量瓶中，加入1.3.1中配制的吡草醚標(biāo)樣溶液4 mL，用甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻。吡草醚的回收率按式（2）計(jì)算。

式中：R為回收率，%；a為測(cè)定量，mg；b為所稱原藥樣品中待測(cè)組分量，mg；c為理論加入量，mg。

經(jīng)測(cè)定，2%吡草醚懸浮劑和2%吡草醚微乳劑的回收率分別為97.45%和97.68%，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明有效成分分析方法準(zhǔn)確度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

利用高效液相色譜法對(duì)2%吡草醚懸浮劑和2%吡草醚微乳劑分別進(jìn)行了定性和定量分析。結(jié)果表明，2%吡草醚懸浮劑和2%吡草醚微乳劑的回收率分別為97.45%和97.68%。所采用的高效液相色譜法準(zhǔn)確度和精密度較高，線性關(guān)系較好，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，能夠作為吡草醚制劑的分析測(cè)定方法。