耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥率及同源性分析

張倩茹，李 甲，鄭 嵐

肺炎克雷伯菌是臨床常見的一種革蘭陰性菌，CHINET監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示其僅次于大腸埃希菌居于臨床分離細(xì)菌的第二位，但耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantK.pneumoniae，CRKP)在耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌中所占比率最大，且近年來有迅速增加的趨勢，給臨床治療和感染控制工作帶來了很大的困難[1]。本研究收集2018年1-8月蚌埠市第三人民醫(yī)院臨床分離的14株CRKP，同時(shí)將其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、耐藥表型篩查、基因檢測和同源性分析，旨在為臨床科室使用抗菌藥物和醫(yī)院感染防控部門提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 14株CRKP分離自本院臨床送檢標(biāo)本(去除同一病人重復(fù)分離的菌株)，其中ICU病房5株，新生兒病房4株，神經(jīng)外科3株，普外科和呼吸內(nèi)科各1株。標(biāo)本類型為痰液9例，尿液2例，血液1例，支氣管和切口分泌物各1例。菌株的分離培養(yǎng)均嚴(yán)格參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第三版)操作，菌株的鑒定使用生物梅里埃公司(法國)的VITEK Compact型全自動(dòng)微生物分析儀鑒定分析至種。質(zhì)控菌株(大腸埃希菌ATCC25922)購于衛(wèi)生部臨檢中心，產(chǎn)KPC-2型肺炎克雷伯菌的陽性對照菌株由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 藥敏試驗(yàn) 應(yīng)用VITEK Compact型全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)作藥敏試驗(yàn)，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2016年標(biāo)準(zhǔn)判斷檢測結(jié)果，藥敏數(shù)據(jù)用WHONET 5.6軟件比對分析。

1.3 產(chǎn)碳青霉烯酶表型篩查 參照2016年CLSI標(biāo)準(zhǔn)操作改良Hodge試驗(yàn)，配制0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊拇竽c埃希菌ATCC25922菌液，用無菌0.9%氯化鈉溶液作10倍稀釋后涂布于M-H平板，平板正中貼10 μg的厄他培南藥敏紙片，待測菌呈放射狀從藥敏紙片的邊緣向平板邊緣作劃線，于35 ℃溫箱中孵育，過夜。結(jié)果觀察以抑菌圈處出現(xiàn)被檢測菌生長增強(qiáng)者(矢狀)為陽性，表示該檢測菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。將已知產(chǎn)KPC-2型肺炎克雷伯菌株作陽性對照菌株，ATCC25922作陰性對照菌株。

1.4 耐藥基因檢測 挑取MH平板上適量菌落，用煮沸法提取細(xì)菌的DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增blaKPC-2耐藥基因。引物和擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)方法[2-3]。KPC-2引物：F5′-TCG CTA AAC TCG AAC AGG-3′，R5′-TTA CTG CCC GTT GAC GCC CAA TCC-3′。PCR 反應(yīng)體系：10 μmol/L上游和下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，模板2.5 μL，加入雙蒸水到25 μL。反應(yīng)的條件：94 ℃預(yù)變性，時(shí)間5 min；94 ℃變性，時(shí)間15 s；55 ℃退火，時(shí)間30 s；72 ℃延伸，時(shí)間35 s；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后置于成像系統(tǒng)觀察、拍照并記錄檢測結(jié)果。

1.5 菌株同源性分析 對14株CRKP應(yīng)用腸桿菌科基因間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)進(jìn)行同源性分析，參考文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計(jì)引物：R5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′，F(xiàn)5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性，時(shí)間3 min；然后94 ℃，時(shí)間60 s；55 ℃，時(shí)間60 s；72 ℃，時(shí)間90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增條帶數(shù)目和位置完全相同者為同一克隆株，主條帶的位置相同，副帶相差1～2條者為亞型或者密切相關(guān)，不符合以上條件者為不同基因型菌株。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 14株CRKP對臨床多種抗菌藥物均表現(xiàn)耐藥，耐藥率見表1。

2.2 改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果 14株CRKP中改良Hodge試驗(yàn)11株陽性，陽性率為 78.57%。改良Hodge試驗(yàn)的陽性待測菌株見圖1。

2.3 耐藥基因KPC-2檢測結(jié)果 以已知產(chǎn)KPC-2型的肺炎克雷伯菌為陽性對照，雙蒸水為陰性對照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示有12株CRKP經(jīng)基因擴(kuò)增后與陽性對照的電泳條帶位置相同，表明檢出KPC-2基因，其陽性率為85.71%，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖2。

表1 14株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥率(%)

2.4 同源性分析結(jié)果 14株CRKP的指紋圖譜見圖3，其擴(kuò)增條帶數(shù)多為3～7條，根據(jù)ERIC-PCR產(chǎn)物電泳指紋圖譜將其分為3個(gè)亞型，其中A型11株(ICU病房5株，神經(jīng)外科3株，新生兒病房2株，普外科1株)，B型2株(新生兒病房2株)，C型1株(呼吸內(nèi)科1株)。

3 討論

CRKP是一種常見的多重耐藥菌，屬于醫(yī)院感染監(jiān)測的目標(biāo)細(xì)菌之一。CRKP的出現(xiàn)常造成臨床抗菌藥物治療的失敗和病人醫(yī)療費(fèi)用及病死率的增加。本研究14株CRKP的藥敏結(jié)果顯示，菌株對包括一至四代頭孢、酶抑制劑復(fù)合物及碳青霉烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率都比較高，對頭孢替坦及氨曲南的耐藥率稍低。對氟喹諾酮類及氨基糖苷類藥物的耐藥率也比較高，僅對磺胺類稍為敏感，表明本院分離的CRKP均表現(xiàn)為高水平耐藥的多重耐藥菌。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物最常見的耐藥機(jī)制是產(chǎn)KPC酶，主要為KPC-2型。繼浙江地區(qū)最早報(bào)道后全國多個(gè)地區(qū)均有陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[5]。改良Hodge試驗(yàn)(MHT)是CLSI推薦檢測碳青霉烯酶表型的方法，本文中11株MHT陽性的菌株在后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)中均檢測到表達(dá)blaKPC-2基因。本研究中尚有2株菌未檢測到KPC-2基因，接下來的研究我們將增加檢測除KPC-2以外的碳青霉烯酶如金屬酶NDM-1、IMP、VIM及OXA-48的基因，編碼這些酶的基因多通過質(zhì)粒介導(dǎo)，可依靠轉(zhuǎn)座子、插入序列等多種基因元件在不同菌株間轉(zhuǎn)移，引起菌株間耐藥基因的水平傳播，易導(dǎo)致耐藥菌引起的醫(yī)院感染暴發(fā)流行[6]。

由于多重耐藥菌株的耐藥表型、基因型及流行分布情況會(huì)因時(shí)間、地域的不同而變化，故了解本醫(yī)院CRKP菌株的分子流行病學(xué)特征對阻斷此類多重耐藥菌傳播和防控醫(yī)院感染具有重要意義。ERIC-PCR方法快速簡便，可作為實(shí)驗(yàn)室菌株同源性分析的方法[7]。本研究顯示本院內(nèi)有產(chǎn)KPC-2型的克隆菌株流行趨勢，主要集中在ICU、神經(jīng)外科和新生兒病房，涉及到的臨床科室應(yīng)積極做好消毒隔離和防護(hù)措施，對醫(yī)務(wù)工作者加強(qiáng)培訓(xùn)，增強(qiáng)一線工作人員對多重耐藥菌醫(yī)院感染控制工作的重視，可以有效防止CRKP的進(jìn)一步傳播和擴(kuò)散。

綜上所述，在檢驗(yàn)科微生物室準(zhǔn)確鑒定耐碳青霉烯類菌株并深入研究其相關(guān)耐藥機(jī)制，臨床醫(yī)生規(guī)范使用碳青霉烯類抗生素的前提下，醫(yī)院感染控制部門還應(yīng)建立更全面的干預(yù)機(jī)制，開展相關(guān)的感染控制措施：盡可能減少對病人不必要的侵襲性操作；規(guī)定在使用抗菌藥物治療前必須做藥敏試驗(yàn)；保持環(huán)境的清潔和消毒；強(qiáng)化醫(yī)務(wù)工作者手衛(wèi)生意識(shí)；制訂嚴(yán)格的接觸隔離預(yù)防措施，為CRKP感染的病人提供單獨(dú)的隔離空間；同時(shí)在高危病房建立積極有效的監(jiān)控機(jī)制等?？傊?，醫(yī)院感染管理科、微生物室和臨床科室應(yīng)加強(qiáng)聯(lián)系，共同監(jiān)測、聯(lián)合督查，才能力爭盡早發(fā)現(xiàn)和阻斷CRKP在院內(nèi)的傳播，預(yù)防多重耐藥菌導(dǎo)致醫(yī)院感染的流行。