黃芩素對慢性萎縮性胃炎大鼠胃粘膜保護(hù)作用的實驗研究※

● 田 華 王小平▲ 張峰利

?

黃芩素對慢性萎縮性胃炎大鼠胃粘膜保護(hù)作用的實驗研究※

● 田 華1王小平1▲張峰利2

目的：從抑制慢性炎癥反應(yīng)的角度探討黃芩素對慢性萎縮性胃炎(CAG)大鼠胃粘膜的保護(hù)機(jī)制。方法：SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、維酶素陽性對照組、黃芩素高(200mg·kg-1)、中(150mg·kg-1)、低(50mg·kg-1)劑量干預(yù)組，除空白對照組外，各組均CAG造模，造模28周后開始灌胃給藥，連續(xù)10周后ELISA法檢測白細(xì)胞介素-8(IL-8)含量，免疫組化法檢測熱休克蛋白70(HSP70)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的蛋白表達(dá)。結(jié)果：黃芩素高、中劑量組的大鼠體征狀況與空白組相似；黃芩素高、中劑量組能顯著降低CAG大鼠的IL-8、NF-κB和COX-2含量，提高HSP70含量。 結(jié)論：黃芩素可能通過降低CAG大鼠的IL-8、NF-κB和COX-2含量從而阻斷了慢性炎癥對胃粘膜長期、反復(fù)的損傷，并通過提高HSP70含量使胃黏膜的抗炎性損害能力增強(qiáng)，從而起到預(yù)防、治療慢性萎縮性胃炎的保護(hù)作用。

慢性萎縮性胃炎 黃芩素 白細(xì)胞介素-8 熱休克蛋白70 核轉(zhuǎn)錄因子-κB 環(huán)氧合酶-2

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率居各類消化系統(tǒng)疾病前列。它是多種致病因素長期作用下，以胃粘膜萎縮為主要特征的一種常見的慢性消化系統(tǒng)疾病，臨床上主要表現(xiàn)為上腹不適、食納減少、消瘦乏力等非特異性癥狀。病理改變可見胃黏膜上皮和固有腺體萎縮，數(shù)目減少，黏膜變薄，或伴幽門腺化生、腸腺化生和不典型增生[1]。若不積極治療，可發(fā)展為胃癌，被認(rèn)為是一種癌前病變，嚴(yán)重危害健康[2]。黃芩素為唇形科植物黃芩的主要活性成分之一，屬于酚類的抗氧化劑[3]，具有較強(qiáng)的抗炎活性和抗腫瘤作用[4]，有研究發(fā)現(xiàn)其對胃癌有一定的抑制作用。本實驗主要從抑制慢性炎癥反應(yīng)的角度探討黃芩素對CAG大鼠胃粘膜的保護(hù)機(jī)制，旨在為中藥預(yù)防、治療慢性萎縮性胃炎提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，雌、雄各半，體重 ( 250±5) g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[許可證號： SCXK (軍) 2009-005]。實驗室飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑 黃芩素由陜西中醫(yī)學(xué)院中藥制劑設(shè)計研究室提供，純度>98%； (N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)購自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司(批號：MV340-RG)；維酶素片購自北海陽光藥業(yè)有限公司(批號：101120)；IL-8檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：H008)；兔抗鼠HSP70多克隆抗體(批號： BAO101055)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(批號：BAO101055)、羊抗鼠COX-2多克隆抗體(批號：BAO101023)和DAB顯色劑(批號：SA2023)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 儀器 光學(xué)顯微鏡 (尼康 DXM1200F型) ，倒置顯微鏡 (尼康 TS100型) ，低溫恒冷切片機(jī)(KD-2800型)，臺式高速離心機(jī)(GENIUS 16K型)，石蠟包埋機(jī)(EG1140型)，脫水機(jī)(TP1020)，烘片機(jī)(ZMN200型)，石蠟切片染色機(jī)(5010型)。

2 方法

2.1 造模 除空白對照組外，其它實驗組小鼠用MNNG復(fù)合法造模[5]：饑飽失常(每進(jìn)食1d，禁食1d)，燙熱高鹽飲食(禁食日3pm用56℃、15%NaCl溶液按10mL·kg-1灌胃)，供給150mg·L-1MNNG溶液(代替飲用水)，0.03%雷尼替丁飼料。進(jìn)行28周。

2.2 分組與給藥 造模28周后，CAG大鼠隨機(jī)分成5組，即模型對照組、維酶素陽性對照組(200mg·kg-1)、黃芩素50，150，200mg·kg-1組[6]，每組12只。每天9am～10am給藥，連續(xù)10周。

2.3 大鼠體征觀察 觀察大鼠毛色、糞便、活動度等一般情況。

2.4 IL-8檢測 取每組大鼠胃組織100mg，加冰生理鹽水2mL后勻漿，35000r·min-1離心10min后取上清液，按試劑盒說明采用ELISA方法檢測IL-8。

2.5 NF-κB、COX-2、HSP70檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟后，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，室溫孵育20min，微波進(jìn)行抗原修復(fù)10min后5%牛血清封閉。加兔抗大鼠一抗，4℃孵育過夜，NF-κB、COX-2、HSP70 1∶100稀釋液。以PBS 代替一抗做陰性對照，以1%的DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，用中性樹膠封片。采用免疫組化法測定NF-κB、COX-2、HSP70的蛋白含量，通過軟件Image-Proplus6.0計算平均光密度值(OD)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的體征情況 空白對照組大鼠的毛色光亮，反應(yīng)靈敏，糞便成形。模型對照組大鼠瘦小，皮毛無光澤，反應(yīng)遲鈍，部分大鼠大便不成形，糞便臭味重。給藥10周后，黃芩素150，200mg·kg-1組及維酶素陽性對照組大鼠體形較前變胖，皮毛較前光澤度明顯提高，活動度增加，反應(yīng)較前靈敏，糞便較前成形。而黃芩素50mg·kg-1組與模型對照組的大鼠一般情況相似。

3.2 黃芩素對CAG大鼠IL-8的影響 模型組大鼠IL-8含量高于正常組大鼠(P<0.05)，黃芩素150，200mg·kg-1組及維酶素陽性對照組IL-8值均低于模型組(P<0.05)，而黃芩素50mg·kg-1組與模型組的IL-8含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 黃芩素對CAG大鼠IL-8的影響

注：與空白組比較△P<0.05，與模型組比較*P<0.05。

3.3 黃芩素對CAG大鼠NF-κB、COX-2、HSP70蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠NF-κB、COX-2含量均高于正常組(P<0.05)。黃芩素150，200mg·kg-1組及維酶素組NF-κB、COX-2含量均低于模型組(均P<0.05)，HSP70含量高于模型組(P<0.05)。而黃芩素50mg·kg-1組與模型組的NF-κB、COX-2、HSP70含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 黃芩素對GAP大鼠NF-κB、COX-2、HSP70蛋白表達(dá)的影響

注：與空白組比較△P<0.05，與模型組比較*P<0.05。

4 討論

世界衛(wèi)生組織( WHO) 已將慢性萎縮性胃炎定義為癌前狀態(tài)，其具有一定的癌變率，嚴(yán)重危害人類的健康[7-9]，若能對慢性萎縮性胃炎進(jìn)行積極治療，則能阻斷其進(jìn)一步發(fā)展為胃癌。該病病因復(fù)雜，病機(jī)不明，給治療帶來了一定的難度。研究表明，該病是在免疫、遺傳、幽門螺桿菌感染(HP)、飲食不當(dāng)及濫用藥物等因素長期復(fù)合作用下[10]，首先引起胃粘膜局部炎癥，進(jìn)而影響到胃粘膜的血運循環(huán)，使胃黏膜的屏障遭到了破壞，粘膜固有腺體開始萎縮，粘膜變薄甚至伴有腸上皮的化生、異型增生而最終導(dǎo)致的。

當(dāng)這些致病因素作用于胃粘膜時，胃粘膜受到刺激后首先釋放炎性趨化因子IL-8，引起局部的炎癥反應(yīng)。這種局部的炎癥反應(yīng)引起胃粘膜發(fā)生早期的損傷。炎性因子IL-8進(jìn)一步作用于NF-κB，使其表達(dá)增強(qiáng)并發(fā)生活化。NF-κB在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞的凋亡、分化過程中都具有十分重要的作用[11]。其中在炎癥反應(yīng)中NF-κB能增加多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，IL-8表達(dá)也隨NF-κB表達(dá)的增多而增多，增多的IL-8又可促進(jìn)NF-κB的進(jìn)一步活化，從而產(chǎn)生炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，使得炎癥反應(yīng)被不斷加強(qiáng)并持續(xù)作用，胃粘膜在這種不斷加強(qiáng)又持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)下反復(fù)損傷，最終朝著CAG 的方向發(fā)展。另外活化后的NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于胞核，在細(xì)胞核內(nèi)與環(huán)氧合酶-2(COX-2)的基因啟動子特異性結(jié)合后使COX-2的合成增加，COX-2是(PG)前列腺素合成過程中的重要限速酶。有研究表明，COX-2蛋白高表達(dá)于癌變和癌前病變的組織中，COX-2主要通過影響前列腺素的合成調(diào)控組織的生物學(xué)行為，它能加重組織的損傷，降低機(jī)體免疫力，引起細(xì)胞的增值表達(dá)，被認(rèn)為是組織發(fā)生癌變過程中的早期事件[12]。HSP70是一類內(nèi)源性保護(hù)蛋白，在早期的炎癥反應(yīng)中即可被細(xì)胞因子誘導(dǎo)合成或合成增加，其抗炎作用在臨床及動物實驗中已被證實[13]。HSP70的高表達(dá)可以重新激活某些酶以維護(hù)細(xì)胞的功能，提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性，維持粘膜的完整。HSP70通過競爭進(jìn)入核孔轉(zhuǎn)運的NF-κB復(fù)合體，達(dá)到抑制NF-κB活化的目的，進(jìn)一步阻斷炎癥因子IL-8等過量產(chǎn)生，使IL-8與NF-κB的炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)被中斷[14]，從而起到抗炎、減輕胃粘膜炎癥損傷作用，保護(hù)胃黏膜，阻止慢性萎縮性胃炎的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示黃芩素可能通過抑制IL-8的釋放、減少NF-κB和COX-2的合成、增加HSP70的合成等環(huán)節(jié)上阻斷了致病因素對胃粘膜的慢性炎癥損傷，從而起到對CAG的治療作用，并發(fā)現(xiàn)這種作用與黃芩素劑量密切相關(guān)，為其臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

[1]Tari A，Kitadai Y，Sumiim M，et al． Basis of decreased risk of gastric cancer in severe atrophic gastritis with eradication of helico-bacter pylori[J]．Dig Dis Sci，2007，52(1) ： 232-239．

[2]唐梅文，王 偉，李桂賢，等．加味七方胃痛顆粒對大鼠實驗性萎縮性胃炎胃黏膜組織超微結(jié)構(gòu)的影響[J].新中醫(yī)，2010，42(5) ： 105 -107．

[3]KAISEROVA H，SIMUNEK T，VAN DER VIJGHW J，et al.Flavonoids asprotectors againstdoxorubicin cardiotoxicity： role of iron chelation，antioxidant activity and inhibition of carbonyl re-ductase[J].Biochim BiophysActa，2007，1772 (9)： 1065-1074.

[4]CHIY S，LIM H，PARK H，et al. Effects ofwogonin，a plant flavone from Scutellaria radix，on skin inflammation： in vivo regulation of inflammation-associated gene expression[J].Biochem Pharmacol，2003，66(7)： 1271-1278.

[5]孔祥茹，楊 巖，李慧臻，等.MNNG不同給藥劑量及途徑對大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2015，33(6)：381-384.

[6]車慶明，楊 琳，陳 穎，等.不同劑量黃芩素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)差異[J].中國新藥雜志，2007，16(8)：604-606.

[7]范堯夫，魏睦新.胃癌癌前病變的研究進(jìn)展及防治對策[J]．世界華人消化雜志，2012，20(20)：1807-1812.

[8]魏小娟，趙治國，崔 鐵.鳥氨酸脫羧酶和c-myc 在胃癌和癌前病變組織表達(dá)及其臨床意義[J].中國實用醫(yī)刊，2011，38(7) ： 52 -54.

[9]董 平，吳文廣，丁琦晨，等.胃癌與上皮內(nèi)瘤變差異基因表達(dá)譜的研究[J].中華實驗外科雜志，2012，29： 2183-2184.

[10]Steere NA，Yamaguchi S，Andrews CA，et al． Functional screen of human MCM2-7 variant alleles for disease-causing potential[J]．Mutat Res，2009，666(1/2) ： 74-78．

[11]MARY KAILEH，RANJAN SEN. Role of NF-kB in the Anti-Inflammatory Effects of Tocotrienols [J]. Journal of the American College of Nutirtion，2010，29(3)：334-339.

[12]HAYDEN M GHOSH S. Shared Principles in NF-kB signaling [J].Cell，2008，132(3)：344-362.

[13]XU CZ，DONG P，LI XY，et al. Expression and clinical significance of hypoxia-inducible factor-1alpha and cyclooxygenase-2 in laryngeal squamous cell carcinoma [J]. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2009，44(1)：57-62.

[14]Wang L，Liu Y，Steinacker JM.Hsp70 response to electrical stimulation in C2C12 cells[J].Exerc Immunol Rev，2010，18：91-102.

國家自然科學(xué)基金項目(No.81172135)

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(712000)

▲通訊作者 王小平，男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子免疫病理學(xué)研究。E-mail:wxpphd@aliyun.com