麝香酮對大鼠脊髓損傷的保護(hù)研究

郭亮 桂菲 李睿夫 于超 羅遠(yuǎn)盟

【摘要】目的：研究麝香酮對大鼠脊髓損傷有無保護(hù)作用。方法：將大鼠隨機(jī)均分為5組：生理鹽水組、甲基強(qiáng)的松龍組、MO1、MO2、MO3組。采用改良艾倫法建立大鼠脊髓損傷模型。大鼠給予麝香酮（MO1：2.5mg/kg，MO2：5mg/kg，MO3：10mg/kg）或甲基強(qiáng)的松龍（MP：30mg/kg）或等量的生理鹽水。連續(xù)觀察4周，ELISA法檢測SOD、MDA、IL-1β，HE、nissl染色進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果：不同濃度的麝香酮對免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元壞死和凋亡均有抑制作用，MOX組下肢功能恢復(fù)優(yōu)于NS組和MP組。MO2比其他組更顯著。結(jié)論：麝香酮具有抗炎、抗凋亡作用，可減輕脊髓損傷后繼發(fā)性損傷，為大鼠神經(jīng)再生提供有利條件。

【關(guān)鍵詞】抗炎藥;星形膠質(zhì)細(xì)胞;膠質(zhì)纖維酸性蛋白;脊髓損傷

【中圖分類號】R ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ?【文章編號】2026-5328（2020）11-027-04

創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI）的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[1]。SCI及其繼發(fā)性損傷可直接導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷，出現(xiàn)不同程度的功能障礙，并且脊髓損傷治療困難[2]，因此致殘率與致死率非常高，不僅患者帶來不便和痛苦，也給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。目前SCI的治療仍是醫(yī)學(xué)的一大難題，SCI的實驗研究也是醫(yī)學(xué)研究的熱點。

本實驗中觀察麝香酮對急性脊髓損傷大鼠脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、SOD、炎癥因子IL-1B及病理學(xué)及行為學(xué)進(jìn)行觀察統(tǒng)計分探討麝香酮對神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞在抗炎方面的作用。

1實驗動物

清潔級SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠120只 （由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。隨機(jī)分成五組，生理鹽水組（NS組）、甲基強(qiáng)的松龍組（MP組）、麝香酮注射液尾靜脈注入組（MO組分3小組：MO1-3組）。MO1組、MO2組、M03組為脊髓損傷后立即分別從尾根靜脈注入2.5mg/kg 、5mg/kg、10mg/kg的麝香酮，持續(xù)7天;MP組術(shù)后立即注入30mg/kg的甲基強(qiáng)的松龍;NS組則注入等量生理鹽水。

2建立大鼠急性脊髓背側(cè)損傷模型（Allen's法[1]）

用4%水全氯醛，以0.35ml/kg行腹腔注射麻醉。其俯臥位固定，腰背部脫毛，典伏消毒鋪巾，以T9棘突為中心作長約2.5cm切口，顯露棘突及椎板，咬除T8-9棘突及全椎板，顯露脊髓，采用Allen氏重物墜落裝置撞擊脊髓背側(cè)，即將質(zhì)量為10g的重錘從距脊髓2.5cm高度垂直沿中空鋼管垂直自由落下撞擊硬脊膜密切接觸，直接傳遞給脊髓。（圖1）

3取材

在相應(yīng)時間點（術(shù)后3h、8h、1d、3d、1w、2w），每組隨機(jī)取3只動物，麻醉動物后在大鼠的外眥取血約1ml。孵化、離心后吸取于PV管內(nèi)立即放于-20度的冰箱在檢測時取出。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA） 、超氧化物歧化酶（SOD）及白介素1β （IL-1β）。

4統(tǒng)計

采用SARS9.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P值<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1成功了急性脊髓損傷模型

采用Allen’S法成功建立了急性脊髓損傷模型（打擊脊髓后鼠尾痙攣性擺動數(shù)次，雙下肢及軀體回縮樣撲動，后雙下肢呈弛緩性癱瘓，大鼠麻醉蘇醒后雙下肢無活動，均需每天人工擠尿兩次）（圖1a/b）。

5.2 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）

5.2.1 SOD檢測

從建模后3小時至1周，NS組SOD出現(xiàn)下降趨勢，從180.87ng/L 降到152.85ng/L，在2周時出現(xiàn)上升達(dá)175.93ng/L。MP組與麝香酮處理的3個組，明顯高于NS組，都從3小時逐漸上升，在術(shù)后3天達(dá)頂峰，以MO3組最為明顯達(dá)289.45ng/L。后出現(xiàn)下降在2周時最明顯，以MO1組最達(dá)184.38ng/L，MP組次之。（圖2）

5.2.2 MDA檢測

從建模后3小時至1周，NS組MDA緩慢上升趨勢，從3.6ng/L 升到4.37ng/L，在2周時出現(xiàn)下降達(dá)4.18ng/L。MO1和MO2在從術(shù)后3小時至3天出現(xiàn)了上升趨勢，較其它3組低，以MO2最低，從2.35 ng/L升至3.13 ng/L，后出現(xiàn)了緩慢下降，以MO2下降最低，達(dá)2.28 ng/L。（圖3）

5.2.3 IL-1β檢測

從術(shù)后3小時至1天，NS組IL-β出現(xiàn)緩慢上升趨勢，從66.59ng/L 升到75.55ng/L，在2周時緩慢下降53.75ng/L。其余四組在同一時間點較NS組低，3小時MP組最低為37.34 ng/L;2周時MO2組最低，1周時達(dá)頂峰，以MO3組相對最高，達(dá)62.49 ng/L（圖4）。

5.3病理學(xué)檢查

5.3.1 HE染色法

在建模后8小時400倍光鏡下能見以生理鹽水組紅細(xì)胞最明顯，甲強(qiáng)龍組次之，在麝香酮5mg組出血較少。1天時組織溶解明顯，從重到輕的順序為生理鹽水組，甲強(qiáng)龍組，麝香酮2.5mg組，組10mg組，麝香酮5mg組。3天時，生理鹽水組脊髓組織溶解，形成空洞;麝香酮2.5mg組出現(xiàn)了空洞，并增生出現(xiàn)，但較生理鹽水組好。一周、二周時脊髓組織廣泛膠質(zhì)細(xì)胞增生，同一天的順序。四周時脊髓組織膠質(zhì)細(xì)胞增生甲強(qiáng)龍組仍見散在的小的空洞存，在3個劑量麝香酮所處理的脊髓空洞基本消失，為膠質(zhì)細(xì)胞所充填（圖5-6）。

5.3.2尼氏染色（Nissl染色法）

在400倍光鏡下8小時五個實驗組不同程度的出現(xiàn)的膠質(zhì)細(xì)胞增生，生理鹽水組較多，較小的神經(jīng)元。1天時膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)增生，生理鹽水組明顯，甲強(qiáng)龍組次之，麝香酮以5mg組增生較少，多個較小的神經(jīng)元。3天時麝香酮處理的3組膠質(zhì)細(xì)胞增生較前兩組少，在這三組中以5mg組較少。一周時膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，生理鹽水組最多，麝香酮處理的3組膠質(zhì)細(xì)胞增生較前兩組少，5mg組較少，各組可見多個較小的神經(jīng)元。兩周時生理鹽水組膠質(zhì)細(xì)胞顯著最多，以2.5mg組增生明顯。四周膠質(zhì)細(xì)胞增生5mg組較少，各組可見多個較小的神經(jīng)元（圖6-7）。

5.4行為學(xué)評分

由兩名醫(yī)師同時在建模后1d，3d，1w，2w，4w時觀察，采用BBB評分方法進(jìn)行獨立評分，最后取平均值作為評分值。術(shù)后第1天，雙下肢功多處0級，隨后雙下肢功能逐漸改善，NS組在4周時達(dá)8.2，MP組達(dá)13.6，麝香酮處理后三組改善明顯優(yōu)于甲強(qiáng)龍組與生理鹽水組，MO2組恢復(fù)最明顯，在2周時達(dá)10.0，4周時達(dá)18.6（圖8）。

6 討論

6.1 脊髓損傷后繼發(fā)性損傷的病理生理

自Allen[1]提出SCI 理論以來，人們對其損傷病理機(jī)制治療進(jìn)行了大量深入的研究，脊髓損傷是由原發(fā)性損傷機(jī)制和繼發(fā)性損傷機(jī)制介導(dǎo)[2-3]。脊髓損傷中心區(qū)出現(xiàn)壞死，神經(jīng)細(xì)胞損傷后，其輪廓能保持約6-8小時，至24小時左右基本崩解，在損傷中心區(qū)邊緣出現(xiàn)細(xì)胞的凋亡[4]。從數(shù)小時到數(shù)周內(nèi)，啟動一系列細(xì)胞和分子水平的生化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致組織缺血、細(xì)胞死亡、軸突脫髓鞘以及膠質(zhì)細(xì)胞喪增生、膠質(zhì)瘢痕形成等繼發(fā)損傷。脊髓組織微循環(huán)障礙，細(xì)胞膜及細(xì)胞器損傷，離子通道失控，出現(xiàn)鈣內(nèi)流，引起自由基反應(yīng)及其介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并引起溶酶體及線粒體的破裂，釋放SOD、MDA等[5-7] ，細(xì)胞功能障礙并最終死亡[8-9]。脊髓損傷也起發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)釋放大量炎癥因子如IL-1β等，使免疫、炎癥反應(yīng)進(jìn)一步的加重[10];后期特別是大量活化膠質(zhì)細(xì)胞聚集，形成膠質(zhì)纖維及疤痕時阻止了神經(jīng)的生長，導(dǎo)致脊髓功能的障礙[11]。

麝香酮抗炎作用非常確切，并通過血腦屏障[12-13]。它使單核細(xì)胞CD54分子表達(dá)及可溶性血管細(xì)胞黏附分子水平有明顯的降低，腦梗死炎癥反應(yīng)得到明顯的抑制，提高了療效[14]。麝香酮對谷氨酸所致PC12細(xì)胞還原能力提高，抑制該細(xì)胞LDH的釋放，提高細(xì)胞存活率;抑制鈣內(nèi)流;降低PC12細(xì)胞的凋亡[15]。中、低劑量的麝香酮能減少對氯胺酮麻醉后乳鼠海馬神經(jīng)元凋亡[16]。麝香酮有類皮質(zhì)激素的抗炎作用，同時無激素的副作用，安全可靠，以及能夠通過血腦屏障，并對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[17]。

6.2 觀察指標(biāo)的分析

在生理鹽水組建模后SOD處較低的水平，并逐漸下降，MDA出現(xiàn)了上升，在一周時達(dá)頂峰，2周有所下降;麝香酮能明顯降低MDA，提高SOD的產(chǎn)量，并優(yōu)于甲強(qiáng)龍，在劑量上以5mg效果最明顯。脊髓損傷引發(fā)免疫、炎癥反應(yīng)，并釋放大量炎癥因子。IL-1β在生理鹽水組出現(xiàn)緩慢上升，1天時達(dá)頂峰，在2周時出現(xiàn)下降。麝香酮處理的3個組在兩周時以MO2組最低。這說明麝香酮與甲強(qiáng)龍有類皮質(zhì)激素的作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎作用[18]。

6.3病理學(xué)及免疫組織化學(xué)

損傷后脊髓組織出血、消腫、固縮及壞死溶解相繼發(fā)生，并在炎癥因子及免疫反應(yīng)下出現(xiàn)單核、巨噬細(xì)胞的浸潤、聚集，打擊區(qū)下方與中央管間出現(xiàn)了空洞，HE染色證實了上述的病理改變。尼氏染色提示：神經(jīng)元尼氏小體都出現(xiàn)了不同程度腫大明顯、碎裂或分布不均，及衛(wèi)星現(xiàn)象。HE、尼氏染色都提示膠質(zhì)細(xì)胞的增生。以生理鹽水組是改變最明顯，壞死明顯，空洞的擴(kuò)大、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)消失大，及增生的膠質(zhì)細(xì)胞，甲強(qiáng)龍組次之。3個劑量麝香酮所處理的脊髓病理改變較輕，以麝香酮5mg/kg損傷最小，提示麝香酮處理的3組后炎癥反應(yīng)被抑制，神經(jīng)元的壞死及凋亡也被抑制，膠質(zhì)細(xì)胞增生被得到控制。抑制了膠質(zhì)細(xì)胞的增生和肥大[19]。而甲強(qiáng)龍對細(xì)胞凋亡作用不明顯，對改判神經(jīng)功能無明顯的作用[20]。

綜上所述，不同濃度的麝香酮對大鼠急性脊髓損傷通過抑制免疫炎癥反應(yīng)，減輕了神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生，改判了急性脊髓損傷后雙下肢的功能，以5mg/kg劑量效果顯著，并優(yōu)于甲強(qiáng)龍，值得進(jìn)一步的深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Matthew J. Eckert，Matthew J. Martin. Trauma：Spinal Cord Injury. Surg Clin N AM. 97（2017）1031-1045.

[2]Christopher S. Ahuja，Satoshi Nori，Lindsay Tetreault，et al. Traumatic Spinal Cord Injury-Repair and Regeneration. Neurosurgery. 80：S9-S22，2017.

[3]Mourelo Fari?a M，Salvador de la Barrera S，Montoto Marqués A，et al. Update on traumatic acute spinal cord injury. Part 2. Med Intensiva. 2017 Jun-Jul;41（5）：306-315.

[4]McDonald JW，Sadowsky C. Spinal-cord injury. Lancet. 2002;359（9304）：417-425.

[5]Keane RW，Kraydieh S，Lotocki G，Bethea JR，Krajewski S，Reed JC，Dietrich WD. Apoptotic and anti-apoptotic mechanisms following spinal cord injury. J Neuropathol Exp Neurol. （2001）60：422-429.

[6]Christopher Witiw;Michael Fehlings. Acute Spinal Cord Injury. Journal of Spinal Disorders and Techniques. 28（6）：202-210，July 2015.

[7]Nakamura M，Houghtling RA，MacArthur L，et al. Differences in cytokine gene expression profile between acute and secondary injury in adult rat spinal cord. Exp Neurol. 2003;184（1）：313-325.

[8]Alejandro Rabinstein. Traumatic Spinal Cord Injury. Lifelong Learning in Neurology. 24（2）：551-566，April 2018.

[9]Meng Y，Xiao Q，Bai JY，et al. Resolution and chiral recognition of muscone as well as actions on neural system. J Asian Nat Prod Res. 2014 Dec;16：1166-70.

[10]Wang N，Chang GJ，Jin QZ，et al. Analysis of mucone from serum and cerebrospinal fluid of rabbits after intragastric administration of tongqiao huoxue granules. Zhong Yao Cai. 2012 35：1291-4.

[11]Zhenzhen Chen，Xin Gong，Yang Lu，et al. Enhancing Effect of Borneol and Muscone on Geniposide Transport across the Human Nasal Epithelial Cell Monolayer. PLOS ONE. 9（7）：e101414，July 2014.

[12]Tevfik Yilmaz，Erkan kaptanoglu. Current and future medical therapeutic strategies for the functional repair of spinal cord injury. World J Orthop

[13]Wang GY，Wang N，Liao HN. Effects of Muscone on the Expression of P-gp，MMP-9 on Blood-Brain Barrier Model In Vitro. Cell Mol Neurobiol. 2015 Nov;35（8）：1105-15.

[14]Seiji Okada，Masamitsu Hara，Kazu Kobayakawa，et al. Astrocyte reactivity and Astrogliosis after spinal cord injury. Neuroscience Research. 126（2018）39-43.

[15]Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC，et al. ASCIMS evaluation of open field locomotor scores：effects of experience and teamwork on reliability，Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study[J]. J Neurotrauma. 1996;13（7）：343-59.

[16]José E，Pereira a，et al. Methylprednisolone fails to improve functional and histological outcome following spinal cord injury in rats[J]. Experimental Neurology. 2009;220（1）：71-81.

[17]石永勇，李向宇，秦凱. 麝香酮對氯胺酮麻醉后乳鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響術(shù)[J].廣東醫(yī)學(xué).2013，34（11）：1645-1645.

[18]Jiang B，Cai F，Gao SH.Induction of cytochrome P450 3A by Shexiang Baoxin Pill and its main components [J]. Chemico-Biological Interactions，2012（195）105–113

[19]Chen ZZn，Yang L，Ying DS，et al.Influence of borneol and muscone on geniposide transport throughMDCK and MDCK-MDR1 cells as blood–brain barrier in vitro model[J].International Journal of Pharmaceutics.2013，456（1）：73-79.

[20]Qian-Qian Liang，Min Zhang，Quan ZHou，et al. Muscone protects Vertebral End-plate Degeneration by Antiinflammatory Property[J]. Clin Orthop Relat Res. （2010）468：1600-1610.

作者簡介：郭亮副教授/副主任醫(yī)師，研究生導(dǎo)師，研究方向;脊柱脊髓損傷。

課題研究：課題來源于重慶市科委自然基金（cstc2016jcyjA0299）

作者單位

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院骨科 ?400300