基于熒光生物傳感器的真菌毒素檢測方法研究進展

董燕婕 梁京蕓 王磊 苑學霞 范麗霞 趙善倉

摘 要：綜述了熒光型真菌毒素檢測生物傳感器的研究進展，重點介紹了熒光型真菌毒素檢測生物傳感器的設計及其靈敏度、特異性等性能，分析了黃曲霉毒素等主要毒素的免疫熒光傳感器和適配體熒光傳感器的檢測方法，提出將來的研究可以針對納米材料/納米復合材料的表面化學調(diào)節(jié)，設計用于檢測各種分析物的目標特定無標簽分析方法，實現(xiàn)毒素的多種同時檢測。

關鍵詞：真菌毒素;生物傳感器;納米材料;熒光猝滅

真菌毒素是產(chǎn)毒霉菌的次生代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的主要產(chǎn)毒真菌有曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮刀菌屬、麥角菌屬、葡萄穗真菌屬和內(nèi)生真菌屬等六大類[1-2]。真菌毒素在收獲前后均可能污染農(nóng)作物，從而使其腐敗變質和品質下降。目前已知有近100種不同種類的產(chǎn)毒真菌，可產(chǎn)生400多種產(chǎn)毒代謝產(chǎn)物。全球25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，不僅引發(fā)嚴重的經(jīng)濟損失，更威脅著人類的健康[3]。真菌毒素污染多發(fā)生在谷物及其制品、油料作物、堅果、奶、肉制品及香料中[4-5]。真菌毒素由于高的肝毒性、致畸性和免疫毒性，導致嚴重的人類健康并發(fā)癥。常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬毒素（FB）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、T-2毒素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、棒曲霉素、桔霉素等。真菌毒素可能發(fā)生在食品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，因此需要快速、實時的監(jiān)測手段以便于及時發(fā)現(xiàn)及預警。生物傳感器是一種便攜式分析設備，它利用生化識別元件對傳感器界面上的分析物質分子進行精確和選擇性的捕獲。自1962年首篇關于生物傳感器的文章問世以來[6]，傳感器在醫(yī)學、制藥、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測中廣泛應用并形成了商業(yè)化體系[7-10]。與傳統(tǒng)的色譜、質譜的檢測方法相比，傳感器具有便攜、成本低、快速的特點，操作步驟簡單，不需要經(jīng)過訓練的專業(yè)人員即可操作，適用于現(xiàn)場和基層的檢測需求。根據(jù)傳感器材料的不同類型，生物傳感器可以是電化學的、光學的、壓電的和量熱的。在所有這些類型的生物傳感器中，光學生物傳感器由于其簡單、靈敏和特異性而具有明顯的優(yōu)勢。光學生物傳感器又分為比色傳感器、熒光傳感器、磷光傳感器、反射傳感器、折射傳感器、表面等離子體共振傳感器、共振色散傳感器、拉曼散射傳感器、紅外吸收傳感器和化學發(fā)光生物傳感器，其中熒光生物傳感器具有很高的靈敏度，在對小分子真菌毒素的檢測上受到了廣泛的關注。本文綜述熒光生物傳感器在真菌毒素檢測中的研究進展，以期為真菌毒素的熒光生物傳感器的技術及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器已經(jīng)被探索用于各種應用，例如醫(yī)療診斷、藥物供應、藥物發(fā)現(xiàn)、環(huán)境監(jiān)測和糧食安全[7-10]。在熒光生物傳感器中可以探索一些參數(shù)，例如熒光強度、熒光各向異性、衰減時間、能量轉移（輻射或非輻射）、衰減效率和量子產(chǎn)量，以檢測不同的分析物。

1.1 熒光生物傳感器的組成

根據(jù)分子自然地表現(xiàn)熒光的特性，例如許多蛋白質和其他生物分子（核酸、NADH、黃素核苷酸、綠色熒光蛋白）具有固有的熒光特性[11]，一旦與配體結合或當配體與這些蛋白質結合時，分子的熒光行為會發(fā)生變化，從而可以對其檢測。相比之下，大多數(shù)分析物是非熒光的。因此，為能被熒光光譜檢測，需使用不同的熒光標記或探針。標簽通過共價作用附著在待測分析物上，通過反應性基團，如羥基、羧基、氨基或巰基，進行化學結合。標記、探針或標簽一般為相對較小尺寸的試劑，由具有固有熒光特性的特定功能組成，使其對附著的分子（核酸、蛋白質或任何其他分子）具有可檢測的敏感性。標簽和探針在對環(huán)境的反應方面是不同的，因此標簽只是共價地附著在分析物上，不會干擾環(huán)境中的其他化學物質，但是熒光探針不應該是惰性的，并且對環(huán)境的反應非常靈敏。適配體是一種很好的生物識別元件，由于其易于直接修飾，具有很高的特異性和選擇性。與其他生物元素（抗體、酶、肽）不同，適配體為其化學修飾提供了很大的靈活性[12-13]。因此，適配體傳感器廣泛應用于農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢測中。熒光適配酶傳感器中最常用的一種形式是使用適配體信標。類似于分子信標，適配體信標有一個發(fā)夾狀結構末端，用熒光團和猝滅劑標記。當靶分子與適配體結合時，待測物的結合會干擾熒光共振能量轉移（FRET）對的初始構象，導致熒光信號開啟[14]。

1.2 熒光標簽的類型

1.2.1 有機染料 有機染料在熒光傳感中被廣泛用作標簽。由于其易獲得、成本低，是最通用的熒光標記材料。最常用的熒光染料是基于花菁結構或黃嘌呤染料。熒光素和羅丹明是第一種用于熒光標記的有機染料，盡管有機染料具有很多的優(yōu)點，但是其存在著pH敏感性、疏水性和蛋白漂白等缺點[15-16]。

1.2.2 作為熒光團和淬火劑的納米材料 為了克服有機染料的技術障礙，半導體量子點[17-18]、上轉換納米顆粒[19]和有機聚合物納米顆粒等納米材料已被作為優(yōu)良的替代品進行了探索[20]。量子點（QDS）是一種高效的信號產(chǎn)生納米探針，是尺寸小于10nm的半導體納米晶體，QDS的光學性質主要取決于組成材料、粒徑、視差（尺寸分布）、量子點類型（核或核殼量子點）和表面化學（用于表面鈍化的材料類型）。因此，通過優(yōu)化這些參數(shù)，可以很容易地獲得特定應用所需的光學特性[21]。硅納米顆粒（Si-NP）是一種在熒光生物傳感器中得到廣泛應用的納米材料。Si-NP具有雙重功能：一種是將Silica-NP用作FRET分析中的固體載體，以便順利處理材料[22-23]，第二種是可用于摻雜不同的熒光染料以增強信號。染料摻雜的二氧化硅納米粒子常被用于檢測核酸、蛋白質和病原體[24-27]。金納米材料由于其優(yōu)異的光學性能，是一種較好的基于FRET的淬火材料[17，28]。銀納米材料（納米顆粒和納米團簇）也是一種有效的FRET受體。在熒光分析中，它們既可作為FRET受體（猝滅劑）發(fā)揮雙重作用，又可為生物測定提供支撐表面，提高分析性能[29]。碳納米管（單壁和多壁）、石墨烯和納米金剛石主要用于光學生物傳感器的制造，以獲得快速可靠的響應[19，23，30]。碳納米管（CNT）和石墨烯被用作基于FRET的分析中許多染料的猝滅劑。熒光生物傳感器中使用的其他納米材料有磁性納米顆粒、納米材料和上轉換納米顆粒[31]。

2 真菌毒素熒光生物傳感器

2.1 免疫傳感平臺

2.1.1 黃曲霉毒素的檢測 由于黃曲霉毒素在食品中污染的嚴重性和普遍性，黃曲霉毒素的免疫熒光檢測平臺得到了廣泛的研究。Wang等[32]報道了一種基于表面等離子體增強熒光光譜（SPF）的牛奶黃曲霉毒素M1（AFM1）檢測平臺。利用表面等離子體（SPS）探測熒光標記物或分析物分子與傳感器表面的結合，檢測牛奶中AFM1，檢出限為6×10-4ng/mL。Tang等[33]報告了一種對AFB1敏感的競爭性免疫測定法。將摻雜的納米材料（羅丹明B，即Rb作為熒光團）二氧化硅納米粒子用作固定單克隆抗AFB1抗體的載體。QDS技術在黃曲霉毒素分析中的應用也引起了人們的廣泛關注[34-35]。Zhang等[36]建立了一種基于色譜時間分辨熒光（TRF）的便攜式免疫傳感器，用于食品和飼料樣品中AFB1的現(xiàn)場測定。該免疫傳感器的線性范圍為0.2～60ng/mL，不同食品和飼料樣品基質的檢出限為0.06～0.12ng/mL，回收率為80.5%～116.7%。Beloglazova等[37]對啤酒樣品中的AFB1進行了快速、簡便的熒光偏振免疫分析，結果表明，啤酒樣品的檢出限為1ng/mL，回收率為89%～114%、黑啤酒樣品為80%～125%。Guo等[38]建立了基于免疫反應原理和全內(nèi)反射熒光（TIRF）實現(xiàn)AFM1檢測的多平面波導熒光免疫傳感器（MPWFI）。免疫傳感器的線性范圍為0.073～0.400ng/mL，檢測限為0.045ng/mL。Lou等[39]開發(fā)了一種利用便攜式消逝波光電流生物傳感平臺（EOBP）檢測AFM1的免疫傳感器，檢出限為0.005ng/mL（附表）。

2.1.2 其他毒素的檢測 針對其他毒素或者多種毒素共存的情況，許多研究建立了熒光免疫快速傳感平臺。Shim等[40]建立了一種基于單克隆抗體的熒光偏振競爭免疫分析法（FPIA）測定小麥樣品中的OTA，線性范圍為5.0×103～200.0×103ng/mL，檢出限為3.0×103ng/mL。Ngundi等[41]建立了同時檢測玉米樣品中的OTA和DON的熒光復合競爭分析法，OTA和DON的檢出限分別為15、150ng/mL。Zezza等[42]基于單克隆抗體和OTA-熒光素示蹤劑，建立了一種基于FPIA的平臺，可快速篩選紅酒中的OTA，檢出限為0.7ng/mL，分析時間不到10min。Vidal等[43]開發(fā)了一種結合熒光檢測器的固相自動萃?。⊿PE）系統(tǒng)，其線性范圍為3～18ng/mL，檢出限為1.2ng/mL。Liang等[44]建立了一種新的熒光耦合酶聯(lián)免疫吸附測定法，利用葡萄糖氧化酶（GOx）介導的量子點熒光猝滅（MPA QDS）檢測OTA，其線性范圍為0.002 4～0.625ng/mL，檢出限為0.002 2ng/mL。Huang等[45]建立了一種改進的競爭性熒光酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），利用過氧化氫（H2O2）誘導的巰基丙酸修飾的CdTe量子點的熒光猝滅檢測OTA，其線性范圍為5×10-5～1×10-4ng/mL，檢測限為5×10-5ng/mL。Jiang等[46]研究了一種銀納米粒子（AgNPS）熒光猝滅競爭耦合橫向流動免疫分析（CLFIA）。CLFIA平臺在葡萄酒中的檢出限為0.06ng/mL。Thompson等[47]利用異源雙功能硅烷共價固定化的單克隆抗體-FB1構建了一種光纖免疫傳感器來測量FB1。免疫傳感器的工作范圍為10～1 000ng/mL FB1，檢出限為10ng/mL。傳感器與FB2發(fā)生交叉反應，但未與水解的FB1、斯芬蘭尼堿或丙三羧酸發(fā)生反應。Urraca等[48]構建了一種檢測谷物樣品中ZEN的靈敏流式免疫傳感器，其線性范圍為0.019～0.422ng/mL，檢出限為0.007ng/mL。Li等[49]開發(fā)了一個同時測定玉米中的FB1和FB2的FPIA平臺。采用FB1-FITC和MAB 4B9對FB2的交叉反應性（CR）為98.9%的FPIA用于同時檢測FB1和FB2，F(xiàn)B1檢出限為157.4ng/mL，F(xiàn)B2的檢出限為290.6ng/mL，檢測時間縮短至30min。Beloglazova等[50]開發(fā)了基于量子點納米標簽的新型多重熒光免疫分析法，用于同時測定幾種真菌毒素，如DON、ZEN、AFB1、T-2毒素和FB1。同時測定DON、ZEN、AFB1、T-2毒素和FB1的檢出限分別為3.2、0.6、0.2、10、0.4ng/mL（附表）。

2.2 基于適配體的檢測技術

2.2.1 黃曲霉毒素的檢測 隨著納米技術和合成受體化學的進步，熒光標簽和適配體/DNA的結合，研究人員開發(fā)了幾種基于熒光的結構切換傳感器或適配體檢測方法。納米材料作為主要的熒光猝滅劑?；跓晒庑盘柈a(chǎn)生的黃曲霉毒素檢測結構轉換分析方法的發(fā)展主要基于與OTA檢測相同的格式。Rhouati等[51]建立了一種基于二氧化鈦和多壁碳納米管復合物的熒光猝滅型適配體傳感器，用于檢測AFB1。Lu等[52]報道了利用QDS和GOX組成的熒光猝滅系統(tǒng)對AFB1進行熒光恢復的適配體分析方法，線性范圍為4.99×10-1～49.96×10-4ng/mL，檢測限為0.44ng/mL。Sharma等[53]設計了一種用于AFM1檢測的結構轉換信號熒光適配體分析，該方法對牛奶中AFM1的檢出限為0.005ng/mL，加標回收率在94.40%～95.28%之間，對AFB1和OTA沒有明顯干擾。Goud等[54]構建了基于羧甲基羅丹明（TAMRA）淬火的AFB1檢測適配體平臺，檢出限為0.2ng/mL，線性范圍為0.25～32ng/mL。Tayebi等[55]設計并評價了兩種基于量子點的熒光適配子，即金納米粒子上的熒光氮摻雜碳點和作為熒光探針的半胱胺封端CdS量子點用于檢測AFB1和黃曲霉毒素總量。Sabet等[56]利用適體共軛熒光量子點（QDS）和金納米粒子作為熒光猝滅劑，研制了一種基于FRET的適體傳感器，用于花生和水稻中AFB1的選擇性和敏感檢測，其檢測限為1.06ng/mL，線性范圍為3.122～124.91ng/mL。Chen等[57]報道了用結構轉換熒光適體分析法檢測嬰兒米粉中的AFB1，檢出限為1.6ng/mL，線性范圍為5～100ng/mL，回收率為93.0%～106.8%。Mukherjee等[58]建立了競爭性熒光適配酶傳感器與高效液相色譜法檢測AFB1的分析方法，回收率為92%～102%。

2.2.2 其他毒素的檢測 基于熒光信號產(chǎn)生的其他毒素檢測結構轉換分析方法的發(fā)展主要基于與黃曲霉毒素檢測相同的模式。Sheng等[59]開發(fā)了一個基于適配體和氧化石墨烯的適配體傳感平臺，其線性檢測范圍為8.01×10-1～14.133×10-3ng/mL，裸GOx的檢出限為0.767ng/mL，PVP改性GOx表面的檢出限為0.955ng/mL。Guo等[60]建立了一種基于單壁碳納米管（SWCNT）為熒光猝滅劑的測定OTA的熒光適能傳感器。與基于GOx的傳感器相比，基于SWCNT的適配體傳感器的檢出限為9.73ng/mL，檢測范圍為10.09～80.76ng/mL。Duan等[61]建立了一種新結構的可切換熒光適配傳感器，其線性范圍為0.002～10ng/mL，檢出限為0.001ng/mL。Chen等[62]設計了一種基于目標誘導結構的開關信號適配體的OTA檢測方法，其線性檢測范圍為1～100ng/mL，檢出限為0.8ng/mL，分析時間不超過1min。Chen等[63]基于熒光DNA支架銀納米團簇、抗OTA適體和磁珠的結構轉換的熒光適體傳感器，檢出限低至0.002ng/mL。Hayat等[64]報道了一種基于熒光的廣義適配設計，采用羧基修飾熒光（CMF）粒子作為信號產(chǎn)生探針，磁性粒子作為固體分離載體。Wang等[65]報道了一種快速檢測農(nóng)產(chǎn)品（如面粉和啤酒）中OTA的熒光法。該方法以高熒光氮摻雜碳點（CD）為能量供體，DNA固定化硫化Ag-NP為能量受體，線性范圍為4.04～2 020ng/mL，檢出限為3.73ng/mL。Wu等[19]報道了一種基于多色上轉換熒光納米粒子（UCNP）作為供體和GOx作為整個有效受體之間的多重FRET的適配體平臺檢測FB1，其線性范圍為0.1～500ng/mL，檢出限為0.1ng/mL。Goud等[66]構建了一種基于熒光猝滅原理的適配體分析方法用于檢測ZEN。在該平臺上，選擇了具有高水分分散性的去角質功能氧化石墨烯（FGOx）作為對FAM熒光的有效熒光猝滅劑。結果表明，F(xiàn)GO比非功能化的GOx具有更高的淬火效率，線性范圍為0.5～64ng/mL和0.5ng/mL。

3 結論

熒光生物傳感器具有分析時間短、成本效益高、操作方便等優(yōu)點，然而，只有一個熒光團分子能被生物受體標記，從而降低了系統(tǒng)的靈敏度。此外，大多數(shù)常用熒光團的熒光壽命以秒為單位，并且需要特定的儲存條件來穩(wěn)定其熒光響應，不適合現(xiàn)場分析。為克服上述問題，最近的研究多集中在熒光納米顆粒作為標記探針用于親和力分析。同時，隨著納米技術的發(fā)展，各種納米材料也被用于構建熒光猝滅法檢測多種毒素。未來的研究可以針對納米材料/納米復合材料的表面化學調(diào)節(jié)，設計用于檢測各種分析物的目標特定無標簽分析方法，實現(xiàn)毒素的多種同時檢測。

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Abstract：The paper reviewed the research progress of the detection of the biological sensor by the fluorescent mycotoxin，introduced the design，sensitivity and specificity of the biological sensor for the detection of the fluorescent mycotoxin，and a number of these fluorescent biosensors have shown promising results in food samples for the detection of mycotoxins，future research can be performed on the modulation of surface chemistry of nanomaterials/nanocomposite to design target specific label free assays for the detection of various analytes.

Keywords：mycotoxins;biosensor;nanomaterial;fluorescence quenching

（責任編輯 唐建敏）