磷脂酰絲氨酸復合膠囊輔助改善記憶功能研究

陳頔 樸瑋 黃建

摘 要：目的：觀察磷脂酰絲氨酸復合膠囊對改善小鼠及人體學習記憶功能的影響。方法：動物實驗部分，昆明種雌性小鼠隨機分為低、中、高 3 個劑量組（劑量分別為 333、667、1 000mg/kg·BW）和陰性對照組，每組共計12只，每48只1個大組進行行為學實驗。連續(xù)灌胃給藥 30d 后，分別進行水迷宮、跳臺和避暗實驗。1周后，小鼠按照相同的數(shù)量和方法重復上述實驗;人體實驗部分，選取49～65歲且知情同意的健康退休人員隨機分為試食和對照組作為研究對象，試食組57人、對照組59人，服用30d，對照組服用相同外觀的軟膠囊安慰劑。實驗開始及結(jié)束時采用中國科學院心理研究所編制的臨床記憶量表測量評估，將各分測驗量表得分和記憶商進行前后和平行比較。結(jié)果：磷脂絲氨酸復合膠囊可延長小鼠跳臺實驗的測驗潛伏期、減少跳臺訓練錯誤次數(shù);小鼠避暗消退實驗的潛伏期延長，差異均具有顯著性意義（P<0.05）。重復實驗也為陽性;試食組57人服用磷脂酰絲氨酸復合膠囊后，各分測量量表得分及記憶商與實驗前比較均有明顯的提高，差異具有顯著性（P<0.05），與對照組比較，試食組各分測驗量表分（除指向記憶）均有所提高，差異具有統(tǒng)計意義（P<0.05）?？偭勘矸趾陀洃浬淘囀辰M試食前后差異顯著，試食后均顯著提高（P<0.05）。結(jié)論：磷脂酰絲氨酸復合膠囊具有輔助改善小鼠及人體學習記憶功能的作用。

關(guān)鍵詞：磷脂酰絲氨酸;行為實驗;學習記憶;臨床記憶量表

神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變以主要癥狀為智力、記憶力語言思維能力不可逆的進行性退化的阿爾茨海默癥最為明顯。本研究復合配方由磷脂酰絲氨酸（PS）、藻油DHA、?；撬岷弯\等有效成分構(gòu)成。DHA主要來源于海洋和淡水微藻的多不飽和脂肪酸，其在大腦神經(jīng)發(fā)育和學習記憶方面起著重要作用[1]。PS作為磷脂家族中的一員，是唯一能夠調(diào)控細胞膜關(guān)鍵蛋白功能狀態(tài)的磷脂[2]，具有改善、修復大腦損傷等功能，成為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”[3]。作為 2010年10月第15號公告國家批準的新資源食品，PS不僅對生理性、損傷性人群的認知能力恢復具有顯著、積極的效應(yīng)，在非損傷性認知能力下降的人群研究中被證明也具有提高認知力的作用[4]。唐勇等[5]在強化PS純牛奶改善記憶力人群試食研究中發(fā)現(xiàn)，每天給予高中生100mg PS強化的牛奶 250mL 40d后，其記憶力顯著提高。李閱兵等[6]在綜述中闡明，DHA能夠促進PS的積累。Chen 等[7]研究了牛磺酸對敲除蛋氨酸硫化物還原酶-A 基因小鼠的抗氧化應(yīng)激作用，結(jié)果表明，牛磺酸可顯著降低心肌線粒體的蛋白氧化水平，提高基因敲除小鼠的抗氧化應(yīng)激能力;鋅是體內(nèi)不可缺少的微量元素，與腦的發(fā)育、腦功能及行為密切相關(guān)，作為基因表達、組織修復以及記憶形成等生物學過程的重要介質(zhì)，近年來的研究顯示，在腦、神經(jīng)元、脊髓和神經(jīng)節(jié)等的神經(jīng)元軸突終末的突觸小泡中富含大量的鋅離子[8]。

本研究按照PS每日攝入量160mg、DHA 80mg、牛磺酸240mg、鋅11.2mg的人體配方，參照2012版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中輔助改善記憶方法進行動物和人體實驗，觀察PS復合膠囊在改善學習記憶中的功效，進一步觀察四種有效成分復合在一起的整體效果，旨在充分研究和評估該受試物在改善記憶功能方面的復合作用和效果。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

PS復合膠囊，內(nèi)容物為類白色顆粒。膠囊規(guī)格：0.5g/粒*60粒/瓶，人體推薦量2.0g/d（2 000mg/60kg·BW）。其標志性有效成分及含量為每100g中含有PS 8.0g、DHA 4.0g、?；撬?2.0g、鋅0.56g。

1.2 實驗動物和人體受試者

1.2.1 實驗動物 第1次實驗：選用中國食品藥品檢定研究院提供的SPF級雌性昆明小鼠144只，18～22個，許可證號為SCXK（京）2014-0013。小鼠飼養(yǎng)于實驗室清潔級動物房，自由飲水。重復實驗：所選小鼠品系，克數(shù)、飼養(yǎng)地點、級別等基本情況均與第1次相同。

1.2.2 人體受試者納入標準 本研究所有受試者均同意并簽署知情同意書。年齡在49～65歲之間，身體健康，無智力障礙，未接受過類似測試且排除短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品;體質(zhì)虛弱無法接受實驗合并有嚴重全身性疾病患者除外。

1.3 實驗劑量分組選擇與受試物給予方式

1.3.1 動物分組與受試方式 該評價實驗共分為3個行為學實驗，每個實驗均將雌性昆明小鼠以人體每日推薦量的10、20、30倍，設(shè)低、中、高等3個劑量組（333、667、1 000mg/kg·BW）和1個隨機對照組，每小組12只，每個行為學實驗共48只。用蒸餾水將受試物配至所需濃度，灌胃量為10mL/kg·BW，每日1次，連續(xù)灌胃30d，對照組灌胃等體積蒸餾水。每周稱小鼠體重2次。

1.3.2 人體分組與受試物使用方法 服樣前對受試者進行第1次記憶商測試后，按記憶商隨機分為試食和對照組，試食組按受試樣品的推薦劑量和方法服用，每日2次，每次2粒，口服30d。對照組服用安慰劑（不含有效成分但外形相同的膠囊）。按雙盲法進行試食實驗，方法及劑量與試食組相同。

1.4 實驗主要儀器與材料

1.4.1 動物實驗儀器 小鼠跳臺儀、小鼠避暗儀、LW-1小鼠水迷宮儀。

1.4.2 人體實驗材料與儀器 臨床記憶量表測試相關(guān)磁帶及圖片材料、錄音機、秒表。

1.5 動物實驗方法

1.5.1 跳臺實驗 連續(xù)灌胃30d后進行跳臺實驗，次日開始訓練。將動物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)3min，立即通以36V交流電刺激小鼠。然后將小鼠放在絕緣平臺上，記錄各小鼠第1次跳下平臺的潛伏期、5min內(nèi)每只鼠受到電擊的次數(shù)（跳下平臺的錯誤次數(shù)）和各組跳下平臺的動物數(shù)，以此作為學習成績。24h后重復測試，記錄第1次跳下平臺的潛伏期、3min內(nèi)跳下平臺的錯誤次數(shù)和各組跳下平臺的動物數(shù)。停止給予受試物繼續(xù)飼養(yǎng)，3d后進行消退實驗。

1.5.2 避暗實驗 末次給受試物后次日開始訓練，記錄每只鼠從放入明室至進入暗室遭電擊所需的時間（潛伏期）、5min內(nèi)進入暗室的錯誤次數(shù)和各組進入暗室的動物數(shù)。24h后同一時間點再進行測驗，記錄每鼠進入暗室的潛伏期、5min內(nèi)進入暗室的錯誤次數(shù)和各組進入暗室的動物數(shù)。停止給予受試物繼續(xù)飼養(yǎng)，3d后進行消退實驗。

1.5.3 水迷宮實驗 末次給樣后次日開始訓練，訓練期間繼續(xù)給予受試物。每天訓練1次，連續(xù)5d。小鼠訓練時間限定為120s，在120s內(nèi)未到達終點的小鼠均記為120s。最后以5d的總學習成績進行評價，計算各組5d到達終點的總時間、總錯誤次數(shù)和各組2min內(nèi)到達終點的動物數(shù)。停止給予受試物繼續(xù)飼養(yǎng)，7d后進行消退實驗。

1.6 人體實驗方法和觀察指標

1.6.1 安全性指標 一般狀況（精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）。血、尿常規(guī)檢查、肝、腎功能檢查等其他基本生化指標。胸透、心電圖、腹部B超檢查（此項且僅實驗前檢查1次）。

1.6.2 功效性指標 臨床記憶量表評估內(nèi)容包括指向記憶、聯(lián)想學習、圖象自由回憶、無意義圖形再認和人像特點聯(lián)系回憶量表分。用測試后的各分測驗原始分查量表分，各分測驗量表分相加得總量表分，用總量表分查記憶商。

1.7 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

動物和人體實驗均使用SPSS軟件統(tǒng)計處理，且以均數(shù)±標準差（X±SD）表示。動物實驗計量資料采用方差分析，進行方差齊性檢驗，用多個實驗組和1個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。計數(shù)資料采用卡方檢驗;人體實驗數(shù)據(jù)為計量資料，對兩組各分測驗量表分和記憶商可用t檢驗進行分析。自身對照可以采用配對t檢驗，組間平行比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物實驗結(jié)果

2.1.1 磷脂酰絲氨酸復合膠囊對小鼠的影響——跳臺實驗 由表1可見，第1次實驗，667 mg/kg·BW劑量組跳臺測驗潛伏期105.3s，較對照組51.3s的潛伏期顯著延長，1 000mg/kg·BW劑量組小鼠跳臺消退實驗潛伏期較對照組顯著延長41.7s，1 000mg/kg·BW劑量組訓練錯誤次數(shù)明顯減少1.5次，667、1 000mg/kg·BW劑量組跳臺測驗錯誤次數(shù)明顯低于對照組，667、1 000mg/kg·BW劑量組測驗跳下平臺的錯誤反應(yīng)率明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;重復實驗中，333 mg/kg·BW劑量組跳臺訓練潛伏期與1 000 mg/kg·BW劑量組跳臺測驗潛伏期與對照組比較顯著延長了35.2s和42.4s，差異具有顯著性（P<0.05）。333mg/kg·BW劑量組跳臺訓練錯誤次數(shù)與333mg/kg·BW劑量組跳臺消退實驗錯誤次數(shù)分別明顯減少了1.1、1.0次，差異具有顯著性（P<0.05）。333、1 000mg/kgBW劑量組消退實驗跳下平臺的錯誤反應(yīng)率與對照組比較下降了58.3%和41.7%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.1.2 磷脂酰絲氨酸復合膠囊對小鼠的影響—避暗實驗 由表2可見，第1次實驗，333、1 000mg/kg·BW劑量組避暗測驗潛伏期較對照組變長63.8s和56.5s，333mg/kg·BW劑量組避暗消退實驗小鼠進入暗室的潛伏期顯著增長48.3s，333、667mg/kg·BW劑量組進入暗室的錯誤次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;重復實驗中，1 000mg/kg·BW劑量組避暗測試錯誤次數(shù)明顯減少0.7次，1 000mg/kg·BW劑量組測試進入暗室的錯誤反應(yīng)率明顯下降66.7%，1 000mg/kg·BW劑量組避暗消退實驗小鼠進入暗室的潛伏期明顯增長，差異均具有顯著性（P<0.05）。

2.1.3 磷脂酰絲氨酸復合膠囊對小鼠的影響—水迷宮實驗 由表3可見，第1次實驗，各劑量組小鼠在記憶獲得和記憶消退階段到達終點前的時間、到達終點前的錯誤次數(shù)和2min內(nèi)到達終點的動物百分率與對照組比較，差異均無顯著性（P>0.05）;重復實驗結(jié)果與第1次結(jié)果完全一致，水迷宮實驗該項結(jié)果判定為陰性。

2.2 人體實驗結(jié)果

2.2.1 一般狀況 本實驗納入受試者120例，試食對照組各60例。試食組脫失受試者3例、對照組脫失受試者1例。有效受試者116例。試食組、對照組受試者脫失率分別為5.0%、1.7%。試食期間未見對人體安全指標產(chǎn)生不良和過敏反應(yīng)，精神、睡眠、飲食、大小便等無明顯變化。受試者實驗前胸透、心電圖、腹部B超等檢查，均在正常范圍。試食前后血、尿、便常規(guī)及血生化各項指標均在正常范圍。試食前兩組患者年齡、性別以及文化水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2.2 對功效指標的影響

（1）試食前后兩組記憶量表得分情況：試食組與對照組比較，試食前，各指標均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），試食后，除指向記憶外，聯(lián)想學習、圖象自由回憶、無意義圖形再認和人像特點聯(lián)系回憶得分均升高（P<0.01）;試食前后比較，對照組各指標均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。試食組各量表得分均顯著增加（P<0.01）（表4）。（2）總量表分和記憶商比較：試食組自身比較以及試食后與對照組比較，總量表分和記憶商均顯著增加（P<0.01）（表5）。

3 討論

學習記憶的行為學方法中最經(jīng)典的實驗方法包括：經(jīng)典條件反射、回避性條件發(fā)射（被動和主動回避性）、操作式學習和辨別性學習[9]。每一種習得性行為都包括學習和記憶過程，跳臺、避暗和水迷宮實驗都是通過觀察對記憶獲得、鞏固、再現(xiàn)的影響來觀察受試物對記憶各過程的影響效果。動物實驗小鼠在跳臺和避暗實驗中的陽性結(jié)果表明，PS復合膠囊能夠有效地改善小鼠的學習記憶能力。

臨床記憶量表是一種比較客觀地測量記憶水平的臨床檢測工具[10]。本研究的人體實驗部分，試食組試食前后各量表得分、總量表分和記憶商均明顯升高（P<0.01）;試食后試食組與對照組比較，除指向記憶無明顯變化外，其他各項得分均明顯升高，總量表分和記憶商也顯著提高（P<0.01）。統(tǒng)計結(jié)果表明，受試物對語文和非語文的記憶能力，即大腦左半球和右半球的記憶功能均有所改善。

Suzuki S等[11]喂食60mg/kg·d經(jīng)轉(zhuǎn)磷脂酰作用合成的大豆磷脂酰絲氨酸（SB-tPS）60d后，對記憶損傷年長大鼠進行Morris實驗，大鼠的行為得到了顯著提高，實驗還發(fā)現(xiàn)，SB-tPS產(chǎn)品能促進乙酰膽堿的釋放和Na+/K+-ATP酶的活性，乙酰膽堿在大腦中不斷積累，腦神經(jīng)細胞間的信息傳遞速度加快，從而起到了促進大腦功能、增強記憶和思維等能力。Jorissen BL等[12]以120名老年ARCD（與年齡相關(guān)的認知能力降低）和AAMI（與年齡相關(guān)的記憶損傷）患者為研究對象每天服用劑量為200mg的PS產(chǎn)品進行營養(yǎng)補充，結(jié)果顯示，經(jīng)過PS產(chǎn)品治療6～12周后，患者各項生化、血液指標及心率等與標準安全指標無顯著差異，該研究證明，PS不僅可改善由年齡引發(fā)的認知能力降低和記憶損傷，而且無副作用產(chǎn)生。本實驗人體部分按照160mg PS的每日攝入量，實驗結(jié)果陽性，安全性等綜合評估與上述評估結(jié)果一致，說明該復合配方中PS的設(shè)計劑量合理。配方另一有效成分DHA同樣也具有改善記憶的功能，徐維盛等[13]在DHA藻油軟膠囊改善小鼠記憶功能的研究結(jié)果表明，折合后推薦的DHA人體使用量在200mg/60kg·d較低量時具有改善記憶的功能，本實驗中，人體實驗復合配方折合80mg/60kg·d的低使用量同樣達到了改善學習記憶的功效，而且人體實驗效果較為明顯。一些研究者通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，單純DHA的增加對神經(jīng)2A細胞不能起到保護作用，而當DHA與PS結(jié)合后才能對2A細胞發(fā)揮保護功能[6];同樣，Kim等[14-16]的研究也發(fā)現(xiàn)，當細胞富含DHA但缺乏PS時，細胞的程序性死亡仍不能被有效阻止。然而，如果將DHA與PS共同來完成改善大腦功能，效果會更加完善，DHA不但可以促進大腦對PS的吸收，同時單純服用DHA，不僅會增加胃腸的負擔，而且也容易氧化，導致吸收效率下降，而且不容易通過血腦屏障[17]。有關(guān)數(shù)據(jù)[18]表明，當DHA連接到溶血磷脂甘油骨架的2位時，其吸收效率是非酯化DHA的10倍。通過以上結(jié)果表明，當DHA與PS兩種成分同時作用時，兩種劑量雖然攝入量均不高，但達到的改善學習記憶的效果則十分明顯。

研究證實，Zn2+在神經(jīng)變性疾病阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病機制中起著重要作用，是 AD 病變時淀粉樣斑塊和淀粉樣腦血管病的重要組成部分。在小鼠模型和 AD 病人的研究中發(fā)現(xiàn)，AD存在時Zn2+穩(wěn)態(tài)是失衡的。研究發(fā)現(xiàn)，鋅穩(wěn)態(tài)失衡（鋅缺乏）能夠引起神經(jīng)元嚴重損害，導致包括 AD 等在內(nèi)的多種神經(jīng)變性疾病的發(fā)生[19]。根據(jù)最新的中國居民膳食推薦攝入量可知，成年人的鋅推薦攝入量為男12.5mg/d、女7.5 mg/d，通過每日添加11.2mg鋅到人體后，可明顯地改善人體的記憶能力。Chang 等[20]研究證實，?；撬崮軌蛲ㄟ^清除線粒體中活性氧含量和 p53 相關(guān)的細胞凋亡通路抑制氧化低密度脂蛋白誘導的己糖激酶 2細胞的毒性，其中 p53 信號通路也是氧化應(yīng)激作用的經(jīng)典通路[21]。李樂慧等[22]在對?；撬岬难趸瘬p傷的保護作用研究中闡明，?；撬崮軌蝻@著降低甲基汞導致的大鼠腦活性氧生成量，顯著增加 SOD、GSH-Px 的活性，巰基、羰基和 MDA 的含量顯著降低。鄭加嘉等[23]對?；撬岬目寡趸芰M行測定的結(jié)果表明，?；撬釋Τ蹶庪x子自由基和羥自由基具有較強的清除作用，且在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。然而，抗氧化及清除自由基損傷能夠影響腦內(nèi)部一系列抗氧化酶系，從而對損傷組織腦神經(jīng)元起到修復、改善作用，所以，每日?；撬?40mg的含量，對于改善學習記憶起到了不可或缺的作用。

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Abstract：Objective ?To observe the effect of phosphatidylserine composite capsule on improving learning and memory function in mice and humans.Method ?In the animal test section，Kunming female mice were randomly divided into low，medium and high dose groups（dose of 333，667 and 1 000 mg/kg·BW，respectively）and a negative control group.There were 12 mice in each group，48 mice in each group were given a behavioral test.After 30 days of continuous gavage，the water maze test，the platform test and the dark test were performed.A week later，another mice were used to repeat the same test in the same number and method.In the human test section，healthy retirees with informed consent of 49～65 years old were randomly divided into the test group and the control group，57 in the test group and 59 in the control group，taking 30 days，and the control group was given a placebo.At the beginning and end of the experiment，the clinical memory scale measurement and evaluation prepared by the Institute of Clinical Psychology of the Chinese Academy of Sciences was used to compare and compare the scores of the subtests with the memory quotient.Result ?The phospholipid serine compound capsule could prolong the test latency of the mouse platform test and reduce the number of mistakes in the platform training.The latency of the mouse darkening regression test was prolonged，and the difference was significant（P<0.05）.Repeated tests were also positive.After taking phosphatidylserine compound capsules，the scores and memory quotient of each score scale in the trial group were significantly higher than those before the experiment（P<0.05）.Compared with the control group，the scores of each score scale（except directional memory）and memory quotient in the trial group were improved，with statistical significance（P<0.05）.The total score and memory quotient test group had significant difference before and after the trial，and significantly increased after the trial（P<0.05）.Conclusion Phosphatidylserine compound capsule has the effect of improving the learning and memory function of mice and human body.

Keywords：phosphatidylserine（PS）;behavior experiment;learning and memory;clinical memory scale

（責任編輯 李婷婷）