短發(fā)卡狀RNA抑制人Bub1基因表達(dá)及其對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞藥物敏感性和周期的影響

周婷 翁丹卉 王世宣 盧運(yùn)萍 馬丁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430030

短發(fā)卡狀RNA抑制人Bub1基因表達(dá)及其對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞藥物敏感性和周期的影響

周婷 翁丹卉 王世宣 盧運(yùn)萍 馬丁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430030

背景與目的：既往研究提示，紫杉醇類藥物作用的發(fā)揮有賴于功能完整的紡錘體檢查點(diǎn)，而Bub1是紡錘體檢查點(diǎn)的重要組成部分。本研究旨在探討B(tài)ub1短發(fā)卡狀RNA真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞紫杉醇敏感性及細(xì)胞周期的影響。方法：構(gòu)建Bub1基因短發(fā)卡狀RNA真核表達(dá)載體pEGFP-Bub1-shRNA，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000包裹空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株A2780后進(jìn)行穩(wěn)定篩選。應(yīng)用RT-PCR、Western印跡法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表達(dá)情況；MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后，A2780細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性及其細(xì)胞周期的變化；Hoechst33342染色法檢測(cè)細(xì)胞分裂指數(shù)。結(jié)果：與對(duì)照組pEGFP-C1/A2780及A2780組相比，pEGFP-Bub1-ShRNA/A2780組細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MTT檢測(cè)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒后細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性明顯降低，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，紫杉醇1 μmol/L處理細(xì)胞24及48 h后,與pEGFP-C1/A2780及A2780組相比，該組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞比例下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Hoechst33342染色提示，與對(duì)照組相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組的分裂指數(shù)（MI）明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Bub1基因的下調(diào)可導(dǎo)致人卵巢癌A2780細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性及G2/M期細(xì)胞比例下降。pEGFP-C1-shBub1質(zhì)粒的成功構(gòu)建，為研究Bub1基因的功能及定位的研究提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)條件。

卵巢癌； Bub1基因； 紫杉醇； 耐藥

細(xì)胞在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體著絲點(diǎn)與微管的連接及其產(chǎn)生的張力，確保姐妹染色單體精確分離的質(zhì)控機(jī)制，即為紡錘體檢查點(diǎn)［1］。紡錘體檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期的最后關(guān)卡，是近年來(lái)細(xì)胞分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。早在上世紀(jì)90年代初，研究人員就在酵母體內(nèi)確定了6種執(zhí)行紡錘體檢查點(diǎn)功能所必需的基因：Bub1、Bub2、Bub3、Mad1、Mad2及Mad3，而蛋白激酶Bub1是紡錘體檢查點(diǎn)的平臺(tái)蛋白。截至目前，有關(guān)紡錘體檢查點(diǎn)的功能尚存在較多爭(zhēng)議，而其精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制更有待于深入探討。紫杉醇作為一線化療藥物在實(shí)體瘤包括乳腺癌及卵巢癌等惡性腫瘤的治療方面取得了巨大成功，但臨床上耐藥病例仍頻繁發(fā)生［2］。眾所周知，紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，通過(guò)抑制微管解聚進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期殺傷腫瘤，而有研究提示這種殺傷作用必須有賴于具有完整功能的紡錘體檢查點(diǎn)。雖然突變?cè)趯?shí)體瘤中并不常見，但紡錘體檢查點(diǎn)功能低下卻時(shí)有發(fā)生。Bub1是否直接影響紡錘體功能并進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的化療耐藥，國(guó)內(nèi)尚未見諸報(bào)道。siRNA在干擾基因表達(dá)的效率和時(shí)長(zhǎng)均顯不足，而本研究通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFPBub1-shRNA質(zhì)粒，使干擾效率大為增強(qiáng)，且其具有更高的穩(wěn)定性，為深入探討卵巢癌細(xì)胞紫杉醇化療耐藥機(jī)制的研究提供了有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑宿主菌大腸埃希菌DH5α由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pEGFP-C1購(gòu)自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本Takara公司；脂質(zhì)體、G418和TRIzol購(gòu)自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）及紫杉醇購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；PCR引物由上海生物工程服務(wù)有限公司合成；抗人Bub1鼠單克隆抗體購(gòu)自Chemicon公司；抗人betaactin鼠單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 人Bub1 shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定對(duì)真核表達(dá)載體pEGFP-C1進(jìn)行測(cè)序后分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切處理，瓊脂糖電泳后回收，純化酶切產(chǎn)物，隨后由PCR反應(yīng)得到，含一個(gè)U6啟動(dòng)子及上述2個(gè)酶切位點(diǎn)的Bub1-shRNA序列（核心序列1為5’-GAGTGATCACGATTTCTAA-3’，核心序列2為5’-CCAUGGGAUUGGAACCCUGTT-3’，核心序列3為5’-CCAGGCUGAACCCAGAGAGTT-3’）以T4連接酶連接3 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。篩選可疑重組陽(yáng)性菌株，以250 r/min（型號(hào)：Crystal, IS-RSD2）的轉(zhuǎn)速，37 ℃搖菌過(guò)夜，小提質(zhì)粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶鑒定，將獲得的人Bub1重組質(zhì)粒命名為pEGFP-Bub1-shRNA，并依次編號(hào)后送Invitrogen測(cè)序。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢上皮性癌細(xì)胞株A2780購(gòu)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（European Collection of Cell Cultures，ECACC），來(lái)源于未經(jīng)治療的卵巢癌患者的癌變組織。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780細(xì)胞接種于6孔板（細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/孔）。待細(xì)胞密度為70%時(shí)，應(yīng)用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體包裹pEGFP-C1空質(zhì)粒和pEGFP-Bub1-shRNA 2種質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，500 mg/L G418加壓篩選14 d左右得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別命名為pEGFP-C1/A2780和pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細(xì)胞。同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的A2780細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Bub1 mRNA的表達(dá)收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，并用M-MLA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；PCR擴(kuò)增以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照。Bub1引物序列（459 bp）上游引物：5’-TAAACCCACAGGAGCCAGGAC-3’，下游引物：5’-CAAGCCTCAACGCCCAACT-3’；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s， 56.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，29個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。GAPDH引物（250 bp）：上游引物：5’-ACGGATTTGGTC-GTATTGGG-3’；下游引物：5’-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、54 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照，每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.5 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞Bub1蛋白水平的差異收集細(xì)胞，提取總蛋白，取40 μg蛋白行SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇激活的PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，用含0.05% Tween20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的堿磷酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫條件下反應(yīng)1 h，用顯色底物NBT/BCIP/AP buffer （1∶1∶250）顯色，以等量β-actin蛋白質(zhì)作為對(duì)照，每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.6 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性取經(jīng)篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)后的各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度（30、90、300和1 000 nmol/L）的用相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋的紫杉醇溶液200 μL，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不加藥物和不加細(xì)胞的對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加1 mg/mL MTT溶液100 μL作用4 h，棄上清液，最后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩使其充分溶解，在96孔板酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm的吸光度值(A)，按下述公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率收集經(jīng)紫杉醇（1 μmol/L）作用24及48 h的各組細(xì)胞，將細(xì)胞先用冷PBS洗滌，75%乙醇于-20 ℃條件下固定過(guò)夜，洗滌細(xì)胞常規(guī)離心（1 500 r/min）15 min （Sigma，No.11030，r=15 cm），加入含有10 μg/mL PI和0.1%RNase A的PBS液500 μL，室溫避光染色30 min后上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期及凋亡率。

1.8 分裂指數(shù)（MI）的測(cè)定各組細(xì)胞接種于蓋玻片上，1 μmol/L紫杉醇處理24 h，10 μg/mL Hoechst33342染液（Sigma Chemical Co. Louis，MO）室溫染色細(xì)胞15 min后PBS洗滌，直接于熒光顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)3個(gè)以上細(xì)胞數(shù)≥100的視野，MI=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功將合成退火片斷與線性載體連接、轉(zhuǎn)化后，挑選單克隆培養(yǎng)于LB培養(yǎng)液搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定插入片段，確定6個(gè)克隆插入一段約360 bp的片斷（含1個(gè)約300 bp的U6啟動(dòng)子），測(cè)序證實(shí)插入為所需片斷（圖1）。

圖 1 人真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Bub1-shRNA的酶切鑒定Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pEGFPBub1-shRNA

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆形成及擴(kuò)大培養(yǎng)pEGFPBub1-shRNA和pEGFP-C1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，500 mg/L G418加壓篩選后，14 d可見克隆形成，隨后依次轉(zhuǎn)入24、12和6孔板及培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，95%以上的細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光（圖2）。

2.3 Bub1 mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)凝膠電泳分析RT-PCR產(chǎn)物，評(píng)價(jià)各組細(xì)胞Bub1 mRNA表達(dá)的差異。由圖3可見，pEGFP-C1/A2780組和A2780組細(xì)胞459 bp處條帶清晰明亮，而pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細(xì)胞在此處僅出現(xiàn)模糊條帶，相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度（Bub1/GAPDH）分別為0.42±0.03、0.45±0.02及0.11±0.03，轉(zhuǎn)染組與2個(gè)對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Western印跡法檢測(cè)Bub1蛋白水平的表達(dá)獲得陽(yáng)性克隆后，通過(guò)Western印跡法驗(yàn)證3組pEGFP-Bub1-shRNA對(duì)Bub1基因的沉默效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)包含核心序列1的質(zhì)粒具有最為明顯的沉默效應(yīng)，故將其命名為pEGFP-Bub1-shRNA，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行。由圖4可見，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細(xì)胞Bub1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度（Bub1/β-actin）為0.13±0.04，而對(duì)照組pEGFP-C1/A2780和A2780細(xì)胞中的Bub1蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為0.58±0.03和0.60±0.02，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細(xì)胞Bub1蛋白表達(dá)水平較其他2組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 轉(zhuǎn)染pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒后各組細(xì)胞的紫杉醇敏感性如圖5所示，pEGFPBub1-shRNA/A2780組細(xì)胞在不同濃度紫杉醇作用下的生長(zhǎng)抑制率均明顯低于pEGFP-C1/A2780細(xì)胞，2組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而pEGFP-C1/A2780和A2780細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，以紫杉醇作用24及48 h，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細(xì)胞的凋亡率均顯著低于其他2組（圖6），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；pEGFP-C1/A2780和A2780細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖 2 pEGFP-C1和pEGFP-Bub1-shRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Fig. 2 The stable expression of pEGFP-C1 and pEGFPBub1-shRNA plasmids transfected in A2780 cells observed by f l uorescent microscope (×40)

圖 3 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bub1 mRNA表達(dá)的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Bub1 mRNA expression in different cells by RTPCR agarose gel electrophoresis

圖 4 Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bub1蛋白的表達(dá)Fig.4 Bub1 protein expression in different cells by Western blotting

圖 5 不同濃度紫杉醇處理后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Fig. 5 The rates of proliferation inhibition treated with paclitaxel in different concentrations

2.6 轉(zhuǎn)染Bub1后細(xì)胞周期的變化由圖7可見，在紫杉醇濃度為1 μmol/L時(shí)，阻滯于G2/M期的細(xì)胞比例最高，故選用該濃度進(jìn)行細(xì)胞周期的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。由圖8及表1可見，1 μmol/L紫杉醇處理24 h后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細(xì)胞的G0/G1、G1/S及G2/M期細(xì)胞的比例分別為（37.1±3.2）%、（24.6±4.4）%和（38.7±2.2）%，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相應(yīng)的比例為（13.3±1.6）%、（14.2±2.3）%和（73.4±5.8）%。由以上數(shù)據(jù)可以看出，轉(zhuǎn)染pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒后，G2/M期細(xì)胞比例明顯降低，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而S期細(xì)胞比例增加，2組間差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。pEGFP-C1/A2780組與A2780組之間則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖 6 紫杉醇處理后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞凋亡率Fig. 6 The rate of apoptotic cells in different groups treated with paclitaxel for different hours

2.7 分裂指數(shù)1 μmol/L紫杉醇處理各組細(xì)胞24 h，pEGFP-C1/A2780組的分裂指數(shù)為（77.8±5.8）%，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組為（33.6±5.8）%，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而pEGFP-C1/A2780與A2780組之間的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖 7 A2780細(xì)胞經(jīng)不同濃度紫杉醇處理24 h后的G2/M期細(xì)胞比例Fig. 7 The rates of G2/M phase A2780 cells treated with paclitaxel by different concentrations for 24 h

圖 8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化Fig. 8 Detection of the diversity of growth phase by f l ow cytometry

表 1 紫杉醇處理24 h后各組細(xì)胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

表 1 紫杉醇處理24 h后各組細(xì)胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

*: P＜0.05, compared with pEGFP-C1/A2780.

Cell cycle G0/G1 S G2/M A2780 12.6±1.5 17.9±2.4 71.4±6.7 pEGFP-C1/A2780 13.3±1.6 14.2±2.3 73.4±5.8 pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 37.1±3.2* 24.6±4.4* 38.7±2.2*Group

3 討 論

化療是治療中、晚期卵巢癌綜合治療必需的手段之一。雖然在接受傳統(tǒng)治療的初期，卵巢癌對(duì)化療藥物的反應(yīng)較為敏感，但因?yàn)橐桩a(chǎn)生耐藥，故而遠(yuǎn)期療效欠佳。有研究提示，紫杉醇類藥物發(fā)揮作用須依賴于功能完整的紡錘體檢查點(diǎn)［3］，有缺陷的紡錘體檢查點(diǎn)不能將細(xì)胞阻滯于G2/M期進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。紡錘體檢查點(diǎn)，是指細(xì)胞在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的一套監(jiān)控紡錘體形態(tài)、染色體排列、染色體著絲粒與微管聯(lián)接及其張力、確保姐妹染色單體精確分離的質(zhì)控機(jī)制［4］。Bub1既是后期促進(jìn)復(fù)合體APC的抑制劑［5］，亦是其底物。Bub1對(duì)于Bub3、BubR1及Mad2等紡錘體組分均具有調(diào)控作用［6］，是紡錘體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和染色體排列所必需的［7］。廣泛的臨床樣本檢測(cè)提示紡錘體檢查點(diǎn)基因突變?cè)趯?shí)體瘤中較罕見［8］，但另一方面，蛋白水平異常導(dǎo)致的紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷卻時(shí)有發(fā)生。Shichiri等［9］發(fā)現(xiàn)：在結(jié)直腸癌組織中，Bub1表達(dá)水平明顯高于鄰近的正常組織。Grabsch等［10］的研究結(jié)果提示，胃癌組織Bub1 mRNA顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖呈相關(guān)關(guān)系。國(guó)內(nèi)亦有關(guān)于Bub1表達(dá)的研究，如李剛強(qiáng)等［11］就通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：Bubl蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

本研究運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)特異性干擾人卵巢癌細(xì)胞A2780中Bub1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，隨后用不同濃度的紫杉醇進(jìn)行處理，MTT結(jié)果提示：Bub1基因的下調(diào)能導(dǎo)致A2780細(xì)胞紫杉醇敏感性的降低，而這與既往研究結(jié)果相一致［12］。此后，通過(guò)流式細(xì)胞分析，本研究發(fā)現(xiàn)：紫杉醇處理24 h后，與對(duì)照組相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，而G0/G1及S期細(xì)胞比例增加。同時(shí)，Hoechst33342染色結(jié)果提示：在轉(zhuǎn)染pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒后，紫杉醇處理24 h，細(xì)胞分裂指數(shù)明顯降低，該實(shí)驗(yàn)為上述細(xì)胞周期分析提供佐證。以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)證明，在沉默Bub1基因后，被阻滯于G2/M期的細(xì)胞明顯減少。當(dāng)轉(zhuǎn)染pEGFP-Bub1-shRNA質(zhì)粒后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)降低。由此，筆者推測(cè)是由于Bub1基因表達(dá)下調(diào)使紡錘體檢查點(diǎn)失活，進(jìn)而導(dǎo)致在紫杉醇作用時(shí)，阻滯于G2/M期的細(xì)胞減少，成功逃逸G2/M期阻滯的這群細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)入周期循環(huán)中而得以存活。

紡錘體檢查點(diǎn)功能缺陷在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的確切作用及其組分對(duì)惡性腫瘤微管抑制劑敏感性的影響，需要科研工作者對(duì)紡錘體檢查點(diǎn)進(jìn)行深入細(xì)致的研究。只有深入了解腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的抵御機(jī)制，才能充分發(fā)揮藥物的殺傷作用，最終為人類惡性腫瘤的防治提供新的策略。

［1］傅云峰, 謝幸, 葉大風(fēng). 腫瘤與紡錘體檢查點(diǎn)的研究現(xiàn)狀［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊(cè), 2005, 32(1): 3-6.

［2］Bergstralh DT, Ting JPY. Microtubule stabilizing agents:their molecular signaling consequences and the potential for enhancement by drug combination ［J］. Cancer Treat Rev,2006, 32(3): 166-179.

［3］Sudo T, Nitta M, Saya H, et al. Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint ［J］.Cancer Res, 2004, 64(7): 2502-2508.

［4］Wassmann K, Benezra R. Mitotic checkpoints: from yeast to cancer ［J］. Curr Opin Genet Dev, 2001, 11(1): 83-90.

［5］Tang Z, Shu H, Oncel D, et al. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint ［J］. Mol Cell, 2004, 16(3): 387-397.

［6］Bharadwaj R, Yu H. The spindle checkpoint, aneuploidy, and cancer ［J］. Oncogene, 2004, 23(11): 2016-2027.

［7］Klebig C, Korinth D, Meraldi P. Bub1 regulates chromosome segregation in a kinetochore-independent manner ［J］. J Cell Biol, 2009, 185(5): 841-858.

［8］Lopes CS, Sunkel CE. The spindle checkpoint: from normal cell division to tumorigenesis ［J］. Arch Med Res, 2003,34(3): 155-165.

［9］Shichiri M, Yoshinaga K, Hisatomi H, et al. Genetic and epigenetic inactivation of mitotic checkpoint genes hBUB1 and hBUBR1 and their relationship to survival ［J］. Cancer Res, 2002, 62(1): 13-17.

［10］Grabsch H, Takeno S, Parsons WJ, et al. Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1, BUBR1, and BUB3 in gastric cancer-association with tumour cell proliferation ［J］. J Pathol, 2003, 200(1): 16-22.

［11］李剛強(qiáng), 周海亞, 朱瑞. 乳腺癌組織中Bub1和p53的表達(dá)與意義［J］. 中華腫瘤防治雜志, 2007, 14(9): 683-685.

［12］Schliekelman M, Cowley DO, O’Quinn R, et al. Impaired Bub1 function in vivo compromises tension-dependent checkpoint function leading to aneuploidy and tumorigenesis ［J］.Cancer Res, 2009, 69(1): 45-54.

Effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid on cell cycle and paclitaxel -sensitivity in human ovarian cancer ceIl line A2780

ZHOU Ting,WENG Dan-hui,WANG Shi-xuan,LU Yun-ping,MA Ding(Department of Department of Obstetrics and Gynecology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei, 430030, China)

WANG Shi-xuan E-mail：sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

Background and purpose：Previous studies have shown that Bub1 was a critical component of the spindle checkpoint. Paclitaxel sensitivity was considered to be dependent on the functionality of this spindle checkpoint. This study investigated the effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid stably transfected into the cell cycle and its sensitivity in human ovarian cancer cell line A2780.Methods：After the pEGFP-Bub1-shRNA plasmid and empty plasmids were constructed, they were transfected into A2780 cells by the Lipofectamine 2000TM. The nontransfected cells were the control. RT-PCR and Western blotting were used to determine the target gene and protein expression. The rate of proliferation inhibition was tested by an MTT assay, apoptosis and cell cycles were determined by flow cytometry, and the mitotic index was determined by Hoechst33342 dye.Results：RT-PCR and Western blotting showed that pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group displayed a low expression of Bub1 compared to the A2780 and pEGFP-C1/A2780 group (P＜0.05). The sensitivity of the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group was significantly lower than the non-transfected and pEGFP-C1/A2780 cells (P＜0.05). Flow cytometry revealed that the rates of G2/M phase and apoptosis were significantly lower in the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group than those in the control group(P＜0.05).Conclusion：Bub1 plays an important role in the paclitaxel treatment. A down-regulation of Bub1 could reduce the drug sensitivity and rate of G2/M cells in human ovarian cancer cell line A2780.

ovarian cancer; Bub1; paclitaxel; resistance

R73-36+1

A

1007-3639(2010)03-0161-06

國(guó)家海外青年學(xué)者合作研究基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30528012）；國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2009CB521800）。

王世宣 E-mail:sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

2009-12-10

2010-02-01）