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    白消安對U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新的影響

    2020-09-13 14:14:10趙艦張良龍金亮張維蘭偉途
    安徽醫(yī)藥 2020年9期
    關(guān)鍵詞:胎牛陽性細(xì)胞膠質(zhì)瘤

    趙艦,張良龍,金亮,張維,蘭偉途

    作者單位:滄州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河北 滄州061000

    研究發(fā)現(xiàn),將神經(jīng)干細(xì)胞的實驗理論方法應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤病人的瘤灶中存在腫瘤干細(xì)胞,其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。目前臨床中對于膠質(zhì)瘤的治療原則主要為抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖,進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤擴(kuò)散的目的[2]。白消安為臨床中緩解性治療慢性粒細(xì)胞白血病的常用藥物之一,或者與其他藥物聯(lián)合使用,清除體內(nèi)造血干細(xì)胞,為慢性髓性白血病病人進(jìn)行干細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)[3]。白消安應(yīng)用于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究較少,因此,本研究于2018年1月至2019年1月,探究白消安對U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新的影響。具體報道如下。

    1 材料與方法

    1.1主要材料U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供;白消安由Sigma 公司提供,與二甲基亞砜相溶(濃度為100μmol/L),保存于-20 ℃條件中,用時再用DMEM/F12 稀釋至所需濃度;DMEM/F12 培養(yǎng)基(由Hyclone 公司提供);胎牛血清(由Gibco 公司提供);胰蛋白酶(由Gibco 公司提供);二甲基亞砜(由Thermo 公司提供);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供)。

    1.2 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)將U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)集中,放置于37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,2~3 d換1次液,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時進(jìn)行傳代。

    1.3 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖情況觀察采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖情況;取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,接種于平底96孔板中,細(xì)胞數(shù)為1×104/孔,培養(yǎng)24 h 后,分為A、B、C、D 組,A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,B、C、D三組分別加入200 μL 含20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養(yǎng)基,四組作用24 h、48 h、72 h 后棄上清,采用MTT 還原法,用酶標(biāo)儀在490 nm 波長檢測吸光度,以其中不含細(xì)胞的空白孔進(jìn)行調(diào)零。

    1.4 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況觀察(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,接種于有無菌玻片的24孔板中,細(xì)胞數(shù)為5×105/孔,培養(yǎng)24 h 后,分為A、B、C、D 組,A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基,B、C、D 三組分別加入 200 μL 含 20、50、100 μmol/L 白消安的DMEM/F12 培養(yǎng)基,培養(yǎng)72 h;取上清,將上清與包被液按照1∶1 混勻,加入96 孔酶標(biāo)板中,放置于4 ℃條件下過夜;之后在37 ℃條件下封閉1.5 h,分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體(均按照1∶1 000稀釋),放置于4 ℃條件下過夜;之后加入二抗(按照1∶1 000 稀釋),在室溫下孵育1.5 h,二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)避光顯色,當(dāng)顏色發(fā)生改變時,停止顯色,在酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測吸光度值。

    (2)免疫組化法:細(xì)胞培養(yǎng)、分組、干預(yù)方法與ELISA法相同;U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,吸出上清,用10%甲醛固定細(xì)胞30 min,室溫下干燥;用內(nèi)源性過氧化物酶滅活;四組分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體(均按照1∶1 000稀釋),放置于4 ℃條件下過夜,之后滴加試劑1,放置于37 ℃條件下20 min,滴加試劑2,放置于37 ℃條件下30 min,DAB避光顯色,之后用蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。將片子放置于顯微鏡下觀察,Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細(xì)胞為胞質(zhì)中黃色或棕褐色顆粒呈彌漫性分布;記錄Bcl-2、Bax、Caspase-3 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù),陽性細(xì)胞表達(dá)率=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.5 U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞細(xì)胞周期觀察取對數(shù)生長期U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,按1×106接種于培養(yǎng)瓶中(T25),培養(yǎng)24 h 后,分為A、D 組,A 組僅加入200 μL 含5%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基,D 組加入200 μL 含 100 μmol/L 白消安的 DMEM/F12 培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h 后,用胰酶消化后,80%冷甲醇固定,過夜,用Annexin V/PI染色,采用流式細(xì)胞分析儀檢測兩組細(xì)胞周期。

    1.6統(tǒng)計學(xué)方法本研究用SPSS 19.0 軟件處理,計量資料采用xˉ±s表示,符合正態(tài)分布計量資料,一般多組間比較采用單因素方差分析,多時點觀測資料的比較采用重復(fù)測量方差分析,多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法;計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗的方法,當(dāng)P<0.05時,認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較培養(yǎng)24 h 后,四組U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)48 h、72 h 后,B、C、D 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度低于A組(P<0.05),且B、C、D 組 U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞大小明顯小于 A 組;培養(yǎng)48 h、72 h后,B、C、D組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體數(shù)據(jù)見表1;代表性圖片見圖1。

    2.2四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況比較C 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細(xì)胞表達(dá)率高于A、B 組(P<0.05);D 組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Caspase-3、Bax/Bcl-2的吸光度值、陽性細(xì)胞表達(dá)率高于A、B組(P<0.05)。見表2。

    表1 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吸光度比較/xˉ±s

    圖1 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞代表性圖片(標(biāo)尺=100 μm,中心細(xì)胞×100,右上角特寫×400):A~D分別為A、B、C、D組

    2.3兩組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞周期比較A 組、D 組處于G1 期細(xì)胞分別占8.20%、3.22%,處于G2/M 期細(xì)胞分別占16.07%、12.18%,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);A組、D組處于G0/G1期細(xì)胞分別占52.27%、58.85%,處于S 期細(xì)胞分別占23.36%、25.75%,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤為惡性程度較高的一種原發(fā)性腦腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的45%[4]。根據(jù)膠質(zhì)瘤的病理及免疫組化,可分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤[5]。研究發(fā)現(xiàn),致癌基因高表達(dá)、抑癌基因失活、細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié),均可影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。因此,相關(guān)致癌基因及其病理機(jī)制的研究在膠質(zhì)瘤的診治中具有重要的意義,成為膠質(zhì)瘤研究熱點。

    腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出,促進(jìn)學(xué)者了解腫瘤發(fā)生機(jī)制[7-8],同時為探尋治療腫瘤的藥物提供依據(jù)。Ignatova等[9]首次發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,隨后大量研究證實實體膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中,存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。齊玲等[10]研究發(fā)現(xiàn),通過分離人新鮮腦腫瘤,直接進(jìn)行培養(yǎng),能夠獲得腦腫瘤干細(xì)胞;而該類細(xì)胞的存在,可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)的原因。雖然膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)瘤實質(zhì)中占的比例較低,但是在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥中起著關(guān)鍵作用[11-12]。

    表2 四組U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡情況比較/xˉ±s

    目前,學(xué)者分離培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞主要有兩種方法:(1)利用流式細(xì)胞儀或者免疫磁珠篩選CD133陽性細(xì)胞或ABCG2陽性細(xì)胞,得到含量較高的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞;(2)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞,采用非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡,而膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成球的特性,進(jìn)行膠質(zhì)瘤干細(xì)胞篩選[13-14]。

    白消安為一種甲烷磺酸類的雙功能烷化劑,研究表明,白消安具有清除骨髓作用,但目前尚無證據(jù)證實白消安對成熟的淋巴細(xì)胞有殺傷作用,因此,有學(xué)者認(rèn)為,在進(jìn)行干細(xì)胞移植治療血液疾病時,可采用白消安聯(lián)合環(huán)磷酰胺進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植預(yù)處理;若環(huán)磷酰胺劑量不足時,可引起早期移植排斥,而白消安劑量不足時,可引起晚期移植排斥[15-17]。李程程等[18]研究發(fā)現(xiàn),白消安可降低機(jī)體外周血白細(xì)胞數(shù)目,同時降低造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞的比例及數(shù)目,誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷,建立造血干細(xì)胞損傷模型,為探尋造血干細(xì)胞損傷機(jī)制提供基礎(chǔ)。

    本次研究發(fā)現(xiàn),高濃度白消安可抑制U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。Caspase-3為凋亡過程中關(guān)鍵蛋白酶之一,起著重要的樞紐作用;是凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶,起著重要樞紐作用;Bcl-2 在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色,其高表達(dá),可抑制細(xì)胞凋亡;Bax在細(xì)胞凋亡過程中的作用與Bcl-2相反,二者產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié),進(jìn)而影響細(xì)胞的存活,通過計算Bax/Bcl-2 值,可了解細(xì)胞生存狀況[19-20]。本次研究結(jié)果顯示,B、C、D 組細(xì)胞吸光度低于A 組,Caspase-3、Bax、Bcl-2 的吸光度值及陽性表達(dá)率升高,G1 期、G2/M 期細(xì)胞所比例較高;結(jié)果說明白消安可抑制U87 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,并且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系,機(jī)制可能與白消安上調(diào)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

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