白藜蘆醇抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究

侯西棟，李 紅，許啟泰，杜鋼軍

（河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004）

腫瘤是指細(xì)胞在致癌因素作用下，基因發(fā)生了改變，失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致單克隆性異常增生而形成的新生物。近年來，許多報道證明了中藥抗肺癌轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢，越來越多的中晚期肺癌患者選擇中藥治療，中醫(yī)治療肺癌也已經(jīng)由單純臨床報道進(jìn)入了較為系統(tǒng)的臨床與實驗相結(jié)合的前瞻性研究，并且開始從分子機(jī)制揭示中藥抗肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制［1］。

白藜蘆醇自1940年首次從毛葉藜蘆的根部獲得，到目前為止發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹等12科、31個屬的72種植物中，其中尤以葡萄皮中含量最高［2］。白藜蘆醇（resveratro，l Res）是一種多酚化合物，是植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機(jī)械損傷而產(chǎn)生的一種植物抗毒素［3］。大量研究［2］表明，白藜蘆醇的藥理作用廣泛，具有抗突變、抗氧化、降低血小板聚集等生物活性，除降低血脂、抗血小板聚集、抑制血管內(nèi)皮因子的釋放外，還能抑制基因的突變、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)早幼細(xì)胞的分化、提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，具有抗腫瘤活性，被譽(yù)為又一新的綠色抗癌藥物。我們實驗用Lewis肺癌和4T1乳腺癌研究白藜蘆醇的體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

2，4－二硝基氯苯（DNCB，上海華碩精細(xì)化學(xué)品有限公司，20040928；無水乙醇（分析純，天津市德思化學(xué)試劑有限公司，20061027）；Tween80（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠，20060824）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，20060702）；丙酮（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，20041111）；印度墨汁（北京篤信精細(xì)制劑廠生產(chǎn)，040823）；白藜蘆醇（純度98%，陜西薈科天然產(chǎn)物有限公司提供，臨用前制成注射用溶液）。

1.2 實驗動物及瘤株

C57BL／6小鼠，雌性，19～23g，北京維通利華試驗動物有限公司提供；昆明種小鼠，雌性，18～23g，購自河南省實驗動物中心；Lewis肺癌瘤株購于上海細(xì)胞所，我們實驗室C57BL／6小鼠自身傳代保存的實體瘤。

1.3 實驗儀器

潔凈工作臺（100級潔凈等級，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；快速混勻器（SK－1，常州國華電器有限公司）；不銹鋼手提式滅菌器（DSX－280A，上海市申安醫(yī)療器械廠）；臺式離心機(jī)（TDL－50B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；倒置生物顯微鏡（XD－1014，南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；ELX 800型酶標(biāo)儀（美國，BIO－TEK）。

2 試驗方法

2.1 對小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響［4］

將在體小鼠Lewis肺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106個／mL。0.2mL／只接種于20只C57BL／6小鼠右足趾皮下，接種次日開始腹腔注射給藥。對照組給予空白溶劑（10mL／kg）；白藜蘆醇實驗治療組給予白藜蘆醇注射劑（10mL／kg）。每組10只小鼠，1 次／d給藥，連續(xù)給藥21d。腫瘤長出后，用排水容積法每周測量腫瘤體積2次。治療結(jié)束次日，將小鼠處死，切除腫瘤、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)，稱重。將稱重后的肺臟以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定24h，再用生理鹽水沖洗，計數(shù)肉眼可見各組肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)（個／片）。

2.2 對小鼠4T1乳腺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響［5－6］

將在體4T1乳腺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106個／mL。0.2mL／只接種于20只C57BL／6小鼠右足趾皮下，接種次日開始腹腔注射給藥。 對照組給予空白溶劑（10mL／kg）；白藜蘆醇實驗治療組給予白藜蘆醇注射劑（10mL／kg）。每組10 只小鼠，1 次／d給藥，連續(xù)給藥21d。腫瘤長出后，用排水容積法每周測量腫瘤體積2次。治療結(jié)束次日，將小鼠處死，切除腫瘤、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)，稱重。將稱重后的肺臟以體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定24h，再用生理鹽水沖洗，計數(shù)肉眼可見各組肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)（個／片）。

2.3 對Lewis肺癌腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)的影響［7］

將在體Lewis肺癌實體瘤組織用組織勻漿器制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞數(shù)2×106個／mL。0.05mL／只接種于20只C57BL／6小鼠尾部皮下，接種次日開始腹腔注射給藥。對照組給予空白溶劑（10mL／kg）；白藜蘆醇實驗治療組給予白藜蘆醇注射劑（10 mL／kg）。每組10只小鼠，1次／d給藥。2周后截去荷瘤鼠尾，按上述腫瘤接種方式再次將Lewis肺癌接種于小鼠后肢皮下，繼續(xù)治療3周。腫瘤長出后，用排水容積法每周測量腫瘤體積2次。治療結(jié)束次日，將小鼠處死，切除腫瘤稱重。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對小鼠Lewis肺癌的影響

白藜蘆醇對小鼠Lewis肺癌原位腫瘤生長有明顯減緩作用，見圖1；能減少肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，見圖2）；對Lewis肺癌荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及淋巴結(jié)大小均無影響，見表1。

圖1 白藜蘆醇對Lewis肺癌皮下腫瘤生長的影響

表1 白藜蘆醇對小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響（，n＝10）

3.2 對小鼠4T1乳腺癌的影響

白藜蘆醇對小鼠4T1乳腺癌原位腫瘤生長有明顯減緩作用，見圖3；能減少肺臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，對4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾臟指數(shù)及淋巴結(jié)大小均有減小作用，見表2。

3.3 對小鼠腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)的影響

白藜蘆醇能促進(jìn)小鼠對Lewis肺癌的相關(guān)免疫反應(yīng)，明顯阻止再次接種腫瘤的生長，見圖4、圖5。

表2 白藜蘆醇對小鼠Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響（，n＝10）

圖2 白藜蘆醇對Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的影響

圖3 白藜蘆醇對4T1乳腺癌皮下腫瘤生長的影響

圖4 白藜蘆醇對Lewis肺癌二次接種皮下腫瘤生長的影響

圖5 白藜蘆醇對Lewis肺癌二次接種皮下腫瘤大小的影響

4 討論

現(xiàn)代腫瘤的治療方法中，化學(xué)療法一直占據(jù)著重要的地位，但是化學(xué)藥物有很強(qiáng)的副作用，其治療效果不理想，而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移這一臨床治療中最大的難題又直接影響著患者的愈后，是患者死亡的主要原因。但是，白藜蘆醇在抗腫瘤的過程中，既能控制腫瘤的生長，也能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

在實驗中，我們對白藜蘆醇抗Lewis肺癌和4T1乳腺癌的轉(zhuǎn)移作用以及對免疫系統(tǒng)的影響做了研究。與對照組相比較，白藜蘆醇能夠明顯地阻止腫瘤從小鼠的右足趾皮下轉(zhuǎn)移到其他的臟器器官，對于轉(zhuǎn)移到肺部的腫瘤，白藜蘆醇也能夠有效抑制其生長。同時，白藜蘆醇能夠促進(jìn)小鼠的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。

有研究表明，白藜蘆醇在腫瘤起始、促進(jìn)和發(fā)展3個階段都有抑制效能。其作用機(jī)制為［8］：①能抗突變、抗氧化。體內(nèi)的氧化水平高低與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，尤其是活性氧自由基的過表達(dá)，除了可以引起機(jī)體DNA 氧化損傷而導(dǎo)致原癌基因活化和抑癌基因失活以外，還可以干擾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、代謝酶等正常表達(dá)和活性，而這些均有一定的促癌作用。白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗氧化活性、清除自由基及影響花生四烯酸代謝的藥理作用。②抑制DNA 合成、阻滯細(xì)胞周期與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇以劑量和時間依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白p21的產(chǎn)生，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cy－clinD1、cyclinD2、cyclinE和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、CDK4、CDK6的表達(dá)，并可降低CDK 活性，造成細(xì)胞周期的阻滯［2］。③誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，凋亡抑制蛋白。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，有學(xué)者［7］報道，白藜蘆醇能下調(diào)成人T 細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞中survivin的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

此外，白藜蘆醇對癌細(xì)胞具有選擇性的殺傷力，同時，對癌癥具有化學(xué)預(yù)防作用，不僅可以用于癌癥的治療，也可用于癌癥的預(yù)防，是一種極有前途的抗癌新藥。

［1］陳堅.中藥抗肺癌轉(zhuǎn)移的實驗研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（1）：82－830.

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［4］韓小芬，杜鋼軍，林海紅，等.硇砂提取物治療小鼠Lewis肺癌的效果初步評價［J］.中藥材，2008，31（2）：2450－2480.

［5］李佳桓，林海紅，杜鋼軍.巴豆不同給藥方式對荷瘤小鼠的影響［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2012，31（1）：8－10.

［6］于麗娟，林海紅，杜鋼軍，等.燈盞花素對小鼠乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)防作用［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，28（3）：182－184.

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［8］張寶紅.白藜蘆醇藥理研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2008，8（3）：66－68.