兩種改良法提取馬鈴薯RNA的對(duì)比

蘭成苑　帥港航　胡艷燕　王用帥

【摘 要】不同的植物組織都有較優(yōu)化RNA提取方法。本試驗(yàn)以馬鈴薯普通栽培品種“師大7號(hào)”和“Δ5”塊莖嫩芽為材料，對(duì)原始的SDS酚法進(jìn)行改良提取總RNA，并與Logeman法比較，通過(guò)電泳實(shí)驗(yàn)比較提取效果，以確定適合幾種植物組織的最優(yōu)RNA提取方法。結(jié)果表明：Logeman法含有輕微的硫氰酸肌鹽污染。而改進(jìn)的SDS酚法優(yōu)解決了淀粉、多糖、多酚等干擾馬鈴薯嫩尖總RNA提取的問(wèn)題。電泳條帶結(jié)果表明：Logeman法提取的總RNA有部分降解，條帶不清晰，部分有托尾現(xiàn)象，改進(jìn)的SDS酚法提取的RNA條帶清晰無(wú)托尾，總RNA質(zhì)量符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

【關(guān)鍵詞】提取RNA馬鈴薯;改進(jìn)的SDS酚法;Logeman法

一、前言

馬鈴薯屬于茄科茄屬一年生草本塊莖植物，主要食用部位是由地下匍匐莖頂端膨大而形成的塊莖——營(yíng)養(yǎng)貯藏器官，淀粉是它的主要貯藏物質(zhì)。具有粘性強(qiáng)、膨脹力強(qiáng)、而且糊化性能好、糊漿透明度高等一系列優(yōu)點(diǎn)，又廣泛應(yīng)用于石油、醫(yī)藥、建筑和紡織等系列眾多領(lǐng)域。但因?yàn)轳R鈴薯松散的淀粉結(jié)構(gòu)，又使其不能在更大范圍內(nèi)發(fā)揮更優(yōu)質(zhì)的作用，所以現(xiàn)在馬鈴薯育種的核心問(wèn)題之一就是進(jìn)一步改良馬鈴薯淀粉現(xiàn)有的加工品質(zhì)。從目前的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，在分子水平上研究其淀粉生物合成關(guān)鍵酶及其基因表達(dá)已然成為了研究中心。而進(jìn)行植物分子生物學(xué)研究[1]的必要前提就是提取植物組織的 RNA，因?yàn)橐獦?gòu)建cDNA 文庫(kù)、進(jìn)行Northern 雜交、 RT-PCR 等都需要高質(zhì)量的 RNA 。同時(shí)，RNA的提取還有助于獲得轉(zhuǎn)錄組，作為連接生物功能的蛋白質(zhì)組和基因組遺傳信息的紐帶。目前被研究最多最深入的生物體調(diào)控方式也就是對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組更能為后續(xù)很多研究提供出更多有用的信息。高效提取優(yōu)質(zhì)RNA也對(duì)轉(zhuǎn)錄組的研究有著重要意義。目前常采用的植物總 RNA 提取方法主要有異硫氰酸胍法、TAB法、Chan法、SDS法、Logeman 、苯酚法 、Trizol 法等。此外，一些商業(yè)化的試劑盒也被用于植物組織 RNA 的提取。但很多方法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于馬鈴薯塊莖含有大量的多糖、酚類(lèi)化合物和次級(jí)代謝產(chǎn)物，液氮研磨過(guò)程中塊莖里大量淀粉會(huì)失水成干粉狀，加入變性液后干粉迅速吸水呈凝膠狀，即使通過(guò)高速離心亦無(wú)法使其與液相分離，導(dǎo)致 RNA 被包裹其中而無(wú)法提取[3]。而塊莖中的多糖會(huì)使 RNA 沉淀難溶于水，或者溶解后成黏稠狀，同時(shí)多糖可以抑制許多酶的活性，嚴(yán)重影響后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn) 。多酚類(lèi)化合物在研磨后勻漿時(shí)會(huì)被釋放出來(lái)，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，被氧化的酚?lèi)化合物（如醌類(lèi)）能與 RNA 穩(wěn)定結(jié)合，從而影響 RNA 的分離純化[4]。這些物質(zhì)不僅會(huì)影響馬鈴薯總 RNA 提取的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和 PCR 擴(kuò)增。除此以外，常用的 RNA 提取方法對(duì)于處理馬鈴薯塊莖此類(lèi)的特殊材料， 還存在分離產(chǎn)量低和污染嚴(yán)重等問(wèn)題。 本試驗(yàn)采用 Logeman法和改進(jìn)的SDS酚法提取馬鈴薯嫩尖 RNA ， 并對(duì)這兩種方法的提取效果進(jìn)行比較與分析，并通過(guò)電泳驗(yàn)證提取所得的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明，Logeman法雖然能提取較多RNA，但其電泳結(jié)果并沒(méi)有改進(jìn)的SDS酚法提取的RNA質(zhì)量好，且存在拖尾現(xiàn)象，條帶不清晰。一般的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下，改良的SDS酚法更有利于多酚類(lèi)植物RNA的提取。

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.準(zhǔn)備過(guò)程：（1）外界環(huán)境RNase 的滅活：RNA提取的前處理。RNA提取過(guò)程中所用研缽、藥匙、玻璃器皿于180℃干熱處理了4h;（2）塑料容器、耗材及配制藥品的H2O均用終濃度為0.1%的DEPC處理過(guò)夜，并用烘箱烘干;（3）試驗(yàn)材料及儀器的預(yù)冷：將剪刀剪下的馬鈴薯嫩尖樣品用1%DEPC水浸泡清洗后，晾干待用;（4）將研缽用液氮進(jìn)行預(yù)冷處理。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程：（1）改良的SDS酚法;（2）Logeman法;（3）凝膠制作;（4）電泳過(guò)程。

三、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

（一）一種方法提取馬鈴薯塊莖總RNA完整性比較

將改良的SDS酚法、Logeman 法提取的馬鈴薯塊莖總 RNA 各2μL，分別加水 10 μL，再加2μL DEPC緩沖液，在1.0% 瓊脂糖凝膠上電泳。由電泳結(jié)果可以看出，Logeman 法提取的兩個(gè)品種的 RNA 有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，改良的SDS酚法提取的 RNA 條帶相對(duì)清晰，且?guī)煷?號(hào)形成的條帶比Δ5形成的條帶要清晰，但查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，導(dǎo)致這種結(jié)果的原因是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作不當(dāng)或者Δ5提取的RNA降解相對(duì)較快，但總的來(lái)說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)提取出的RNA可以作對(duì)比所用。

現(xiàn)在用的是DNA的markertk，但并不影響比較過(guò)程，結(jié)果僅供參考。

本圖示中“1”為改進(jìn)的SDS酚法提取“師大7號(hào)”的RNA電泳結(jié)果;

“2”為L(zhǎng)ogeman 法提取的“師大7號(hào)”的RNA電泳結(jié)果;

“3”為改進(jìn)的SDS酚法提取“Δ5”的RNA電泳結(jié)果;

“4”為L(zhǎng)ogeman 法提取“Δ5”的RNA電泳結(jié)果;

（二）兩種方法提取馬鈴薯塊莖操作程序比較（表2）

Logeman法、改進(jìn)的SDS酚法種方法都經(jīng)過(guò)研磨、抽提、沉淀、洗滌等步驟，各方法只有研磨一致，其余步驟都有所區(qū)別，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間差異較大，但改進(jìn)的SDS酚法各種實(shí)驗(yàn)試劑步驟相對(duì)更適合現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室操作。

四、結(jié)論

Logeman法利用鹽酸胍、β-巰基乙醇2 種試劑來(lái)抑制 RNase 活性，同時(shí)裂解核蛋白，酚、氯仿反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，醋酸和乙醇選擇性沉淀 RNA，然后再用 3 mol/L 醋酸鈉（pH值為5.2）去除多糖，可大量提取馬鈴薯塊莖總 RNA。但本實(shí)驗(yàn)中Logeman 法未得到較高質(zhì)量的 RNA，原因在于實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中可能存在誤差，且降解程度較大，相比之下，沒(méi)有改進(jìn)的SDS酚法提取RNA的效果好。但其成本較低，且耗時(shí)相對(duì)較少，也不失為一個(gè)規(guī)范操作以提取RNA的好方法。

改進(jìn)的SDS酚法用異丙醇兩次，最后對(duì)沉淀洗滌兩次，且電泳結(jié)果表明：改進(jìn)的SDS酚法提取的RNA完整性相對(duì)較好;整個(gè)過(guò)程無(wú)試劑污染，更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。

【參考文獻(xiàn)】

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[2]王關(guān)林，方宏筠. 植物基因工程原理和技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998：609.

[3]楊建文，宋波濤，李亞軍，等. 一種簡(jiǎn)單有效的提取馬鈴薯塊莖總RNA 方法[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14 （2）：297 -298.

[4]趙亞力，馬學(xué)斌. 分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：清華大學(xué)出版社，2006：49 -53.

作者簡(jiǎn)介：蘭成苑、性別：女、籍貫：四川內(nèi)江、研究方向：教育;胡艷燕、性別：女、籍貫：江西撫州、研究方向：教育;帥港航、性別：男、籍貫：四川德陽(yáng)、研究方向：生物教育;王用帥、性別：男、籍貫：四川資陽(yáng)、研究方向：教育。