不同培養(yǎng)條件下杏鮑菇對(duì)硒的耐受性與硒形態(tài)分析

杜芳 鄒亞杰 張海軍 胡清秀

摘 要：為了明確不同培養(yǎng)條件下杏鮑菇對(duì)外源硒的耐受性，分別在固體培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基和栽培基質(zhì)中添加不同量的亞硒酸鈉，并檢測(cè)杏鮑菇子實(shí)體中富集硒的存在形態(tài)。結(jié)果表明：固體培養(yǎng)條件下，硒濃度低于160 mg/L時(shí)，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響;液體培養(yǎng)條件下，4 mg/L的硒元素即可對(duì)杏鮑菇菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制;栽培模式下，基質(zhì)中補(bǔ)充10～600 mg/kg的硒元素，不會(huì)影響杏鮑菇菌絲體的生長(zhǎng)，且子實(shí)體中的硒含量會(huì)隨基質(zhì)中硒濃度的增加而增加。子實(shí)體硒形態(tài)分析表明，富集硒以硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸和亞硒酸鹽[Se（IV）]四種形式存在，其中硒代蛋氨酸是硒與氨基酸的主要結(jié)合形式。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇;硒耐受力;硒形態(tài);硒代氨基酸

硒是人與動(dòng)物正常生理活動(dòng)所必需的一種重要微量元素，在體內(nèi)參與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶以及碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白組和酶的合成，在抗突變、防衰老、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面發(fā)揮重要生物學(xué)功能[1-2]。1988年，中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)將硒列為15種每日膳食營(yíng)養(yǎng)元素之一，每人每日必需攝入50～250 μg的硒。我國(guó)是一個(gè)嚴(yán)重缺硒的國(guó)家，有72%的地區(qū)缺硒、30%的地區(qū)嚴(yán)重缺硒，人體硒攝入不足會(huì)引起大骨節(jié)病及克山病等一系列病癥的發(fā)生[3]。自然界中的硒元素以無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形態(tài)存在，無(wú)機(jī)硒一般指從金屬礦藏的副產(chǎn)品中獲得的亞硒酸鈉和硒酸鈉;有機(jī)硒一般以硒蛋白（功能蛋白及酶類(lèi)）、硒多糖、硒核酸等形式存在[4]。毒理實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)機(jī)硒酸鹽對(duì)人體毒性大，要滿足人體對(duì)硒元素的需求，需要將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為更易被人體吸收且安全性更高的有機(jī)硒[5]。食用菌是良好的硒生物轉(zhuǎn)化載體，能夠?qū)h(huán)境中的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為低毒、高效的有機(jī)硒，且自身含有豐富的蛋白質(zhì)和多種營(yíng)養(yǎng)元素，是開(kāi)發(fā)富硒產(chǎn)品的研究熱點(diǎn)[6]。杏鮑菇菇質(zhì)脆嫩，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，是已實(shí)現(xiàn)工廠化栽培的一種大型真菌。根據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2017年杏鮑菇總產(chǎn)量已達(dá)159.7萬(wàn)t，產(chǎn)品遍及各大小超市、菜市場(chǎng)，是飯桌上常見(jiàn)的食用菌品種。杏鮑菇生產(chǎn)周期快、市場(chǎng)需求量大使之成為開(kāi)發(fā)食用菌富硒制品的優(yōu)選品種。研究表明，杏鮑菇菌絲體和子實(shí)體具有良好的富集、吸收和轉(zhuǎn)化硒的能力[7-8]，因此，杏鮑菇可作為一種硒補(bǔ)充的重要來(lái)源。雖然前人對(duì)杏鮑菇的富硒能力進(jìn)行了研究，但尚未系統(tǒng)地研究杏鮑菇對(duì)硒的耐受性，硒濃度過(guò)高會(huì)對(duì)杏鮑菇的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒害作用。本研究將對(duì)液體發(fā)酵、PDA平板培養(yǎng)、栽培條件下杏鮑菇菌絲體對(duì)硒的耐受狀況進(jìn)行比較，并對(duì)杏鮑菇子實(shí)體中富集硒的含量和形態(tài)進(jìn)行全面分析，為富硒杏鮑菇產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 杏鮑菇ACCC52611，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 平板基本培養(yǎng)基配方（g/L）：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，pH 7.33（滅菌前）。液體基本培養(yǎng)基配方（g/L）：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g，pH 7.33（滅菌前）。栽培基質(zhì)基本配方：木屑21%、甘蔗渣21%、麥麩18.4%、玉米芯18.4%、豆粕8.4%、玉米粉6.6%、棉籽殼4.2%、石灰1%、石膏1%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 杏鮑菇的富硒平板培養(yǎng) 配制平板基本培養(yǎng)基，按表1的方案添加亞硒酸鈉，使各處理中的硒濃度依次為4、8、12、16、20、40、80、120、160、200 mg/L。滅菌后倒板，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，待培養(yǎng)基凝固后接種菌塊，于22 ℃暗培養(yǎng)，菌絲萌發(fā)后，每2 d測(cè)量1次菌絲生長(zhǎng)半徑，直至菌絲長(zhǎng)滿平板。

1.2.2 杏鮑菇的富硒液體發(fā)酵 配制液體培養(yǎng)基，于250 mL三角瓶中分裝100 mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取亞硒酸鈉于各三角瓶中，使液體培養(yǎng)基中的硒濃度依次為4、8、12、16、20、50、100 mg/L，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。滅菌后接入3個(gè)菌塊，于22 ℃、130 r/min條件下暗培養(yǎng)14 d。收集菌絲球，清洗、過(guò)濾并烘干（45 ℃），測(cè)定菌球干重（表2）。

1.2.3 栽培基質(zhì)中添加亞硒酸鈉實(shí)驗(yàn) 在杏鮑菇栽培配方中按表3的方案添加亞硒酸鈉，使栽培基質(zhì)中的硒濃度分別為10、50、100、150、200、300、600 mg/kg（表3）。充分拌勻，每個(gè)處理110包，平均每袋干料重550 g，含水量為65%～68%。裝袋后按常規(guī)方式進(jìn)行滅菌、接種、發(fā)菌和出菇管理。記錄菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量等。將杏鮑菇子實(shí)體于60 ℃烘干，粉碎研磨后為待測(cè)樣品。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量分析 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法，采用凱氏定氮法測(cè)定杏鮑菇子實(shí)體中粗蛋白的含量。

1.2.5 杏鮑菇子實(shí)體中硒含量測(cè)定與富集系數(shù)分析 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》中的方法，采用微波消解-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）測(cè)定樣品中總硒含量[9]。富集系數(shù)（BCF）：食用菌子實(shí)體中某種元素的含量與相應(yīng)栽培料中該元素含量之比。BCF越大，則說(shuō)明富集能力越強(qiáng)。

1.2.6 杏鮑菇子實(shí)體中硒代氨基酸形態(tài)分析 杏鮑菇產(chǎn)品風(fēng)干樣品研磨處理后，稱(chēng)取定量樣品溶于水中，加足量蛋白酶水解后利用液相色譜-原子熒光光譜儀聯(lián)用（LC-UV-AFS，北京）進(jìn)行硒代氨基酸形態(tài)的測(cè)定，可檢測(cè)甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）等3種硒代氨基酸和4價(jià)硒[Se（IV）]含量[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板培養(yǎng)條件下硒元素對(duì)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的影響

平板培養(yǎng)條件下，杏鮑菇菌絲體對(duì)硒的耐受性較強(qiáng)，硒濃度低于160 mg/L時(shí)，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響;硒濃度大于200 mg/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（圖1）。在固體培養(yǎng)條件下，杏鮑菇菌絲體生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面，與硒的接觸有限，且基質(zhì)中的硒濃度會(huì)隨著菌絲的富集作用而逐漸下降，不會(huì)對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用。此外，PDA培養(yǎng)基中含有的瓊脂等大分子物質(zhì)可能會(huì)與硒元素緊密螯合，也可以降低硒的毒性作用。由此可見(jiàn)，在固體培養(yǎng)條件下進(jìn)行菌絲對(duì)硒的富集，培養(yǎng)基中硒的適宜添加濃度為40～80 mg/L。

2.2 液體發(fā)酵條件下硒的添加對(duì)杏鮑菇菌絲生物量的影響 ?液體發(fā)酵條件下，硒濃度為4 mg/L時(shí)，即可對(duì)杏鮑菇菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制（圖2）;當(dāng)發(fā)酵液中的硒濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制，生物量?jī)H為1 g/L;硒濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，杏鮑菇菌絲停止生長(zhǎng)，生物量為0 g/L。液體發(fā)酵條件下，振蕩中的菌絲球全方位地接觸硒元素，導(dǎo)致杏鮑菇菌絲體對(duì)硒元素非常敏感，菌絲生長(zhǎng)速度受到強(qiáng)烈抑制。

2.3 硒元素對(duì)杏鮑菇子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

栽培基質(zhì)中添加10～600 mg/kg的硒元素時(shí)，杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的速度不受影響，菌絲長(zhǎng)滿菌袋的時(shí)間相近。當(dāng)基質(zhì)中硒元素的添加量為10 mg/kg時(shí)，杏鮑菇的單位產(chǎn)量[（328.6±24.2） g]與對(duì)照組[（308.3±29.3）g]相比顯著提高，之后，隨著硒添加量的增加，產(chǎn)量未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的添加濃度范圍內(nèi)，微量元素硒對(duì)杏鮑菇的產(chǎn)量影響不明顯。此外，與對(duì)照相比，各添加配方之間杏鮑菇的農(nóng)藝性狀并沒(méi)有顯著差別，說(shuō)明亞硒酸鈉的添加對(duì)杏鮑菇的農(nóng)藝性狀無(wú)顯著影響（表4）。

2.4 杏鮑菇子實(shí)體對(duì)硒的富集作用

栽培基質(zhì)中添加亞硒酸鈉時(shí)，杏鮑菇子實(shí)體中的硒含量明顯高于對(duì)照，且提高程度隨外源硒添加量的升高而增加（表5）。栽培基質(zhì)中硒元素添加濃度為10 mg/kg時(shí)，BCF最高（0.528），富集效果最好;硒添加量為100～200 mg/kg時(shí)，子實(shí)體硒含量維持在35～40 mg/kg，未呈現(xiàn)明顯提高趨勢(shì)。硒添加濃度在300～600 mg/kg時(shí)，子實(shí)體中的硒含量隨添加濃度的升高相應(yīng)提高，但BCF基本保持不變。上述結(jié)果表明，杏鮑菇具有較強(qiáng)的富硒能力，低濃度時(shí)，富集作用較強(qiáng);高濃度時(shí)，富集作用較弱。

2.5 子實(shí)體中的硒形態(tài)分析及蛋白質(zhì)含量

LC-UV-AFS測(cè)定結(jié)果表明，不同硒添加濃度處理中，杏鮑菇子實(shí)體中富集到的硒元素主要以SeMet和亞硒酸鹽[（Se（IV）]的形式存在，分別占總硒含量的28.76%～71.38%和25%～61.96%。而硒代胱氨酸（SeCys2）含量和甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）含量占總硒含量的10%以下。采用凱氏定氮法測(cè)定杏鮑菇子實(shí)體中粗蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)在栽培基質(zhì)中補(bǔ)充亞硒酸鈉，可以提高子實(shí)體中的蛋白質(zhì)含量（表6），但蛋白質(zhì)含量不隨基質(zhì)中硒添加量的增加而增加，各添加配方之間蛋白質(zhì)含量差異較小。

3 討論

食用菌菌絲體和子實(shí)體中富含蛋白質(zhì)和多糖，利用食用菌作為富硒載體，可以將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為蛋白硒和多糖硒。食用菌進(jìn)行硒的生物轉(zhuǎn)化主要通過(guò)向栽培基質(zhì)或發(fā)酵液中添加外源硒（硒酸鈉、亞硒酸鈉、SeMet等）進(jìn)行人工培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)的。培養(yǎng)條件不同，食用菌對(duì)硒元素的耐受能力不同。本研究表明，杏鮑菇菌絲體在PDA平板培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)和人工栽培模式下對(duì)硒的耐受性存在很大差異。平板培養(yǎng)條件下，加入適量的硒（40～80 mg/kg），可促進(jìn)杏鮑菇菌絲的生長(zhǎng)，但濃度高于160 mg/kg，菌絲生長(zhǎng)速度會(huì)受到抑制;液體搖瓶培養(yǎng)條件下，杏鮑菇菌絲對(duì)硒元素非常敏感，4 mg/L的濃度即可以抑制菌絲的生長(zhǎng)，這與孫中濤等[11]報(bào)道的低濃度硒即可對(duì)香菇菌絲體（液體發(fā)酵）產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制的結(jié)果一致。栽培模式下，菌絲對(duì)硒的耐受性非常高，基質(zhì)中補(bǔ)充600 mg/kg的硒元素，菌絲仍然可以正常生長(zhǎng)，且產(chǎn)量與對(duì)照相比差異不顯著。基質(zhì)中補(bǔ)充低濃度（10 mg/kg）硒時(shí)，杏鮑菇的單位產(chǎn)量最高，相比對(duì)照提高6.6%。由此可見(jiàn)，培養(yǎng)方式不同，杏鮑菇對(duì)硒元素的耐受性完全不同。

硒在生物體內(nèi)富集轉(zhuǎn)化的同時(shí)，SeMet和硒代半胱氨酸取代蛋氨酸和半胱氨酸，參與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白質(zhì)的合成，具有重要的生理功能[12]。本研究中，栽培基質(zhì)中添加的硒元素被大量富集至杏鮑菇子實(shí)體中，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，主要以4種硒形態(tài)存在：即SeMet、SeCys2、MeSeCys和Se（IV）?，F(xiàn)有研究表明，富硒食用菌中的有機(jī)硒形態(tài)主要是SeMet，同時(shí)還存在SeCys2、MeSeCys等有機(jī)硒形態(tài)，部分富硒食用菌中還存在Se（IV）和Se（VI），如富硒香菇子實(shí)體中硒主要以SeMet和MeSeCys 2種形態(tài)存在[13];硒酸鈉處理的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中主要以SeCys2和SeMet形態(tài)存在，還存在少量Se（VI）;硒代蛋氨酸處理下蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中硒主要以SeCys2和SeMet形態(tài)存在，還存在一種未知的硒形態(tài)[14]，這與食用菌種類(lèi)、外源硒類(lèi)型和添加量有關(guān)。本研究中，富硒杏鮑菇子實(shí)體中的硒主要以SeMet和Se（IV）2種形態(tài)存在。

目前對(duì)富硒食用菌的研究主要集中在培養(yǎng)條件及方式、硒含量和形態(tài)，以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等方面，而食用菌對(duì)不同形態(tài)硒的吸收通道和轉(zhuǎn)化過(guò)程尚不明確，是未來(lái)需要努力攻克的方向?！?/p>

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Abstract：To clarify the tolerance of exogenous selenium to Pleurotus eryngii under different culture conditions，different concentrations of sodium selenite were added to the solid medium，liquid fermentation medium and cultivation substrate，respectively.The tolerance to selenium under different culture conditions were compared，and selenium species in P.eryngii fruiting bodies were also detected.The results showed that selenium concentration，which was less than 160 mg/L，had no significant effect on the growth of mycelia under solid culture condition，while under the condition of liquid culture，4 mg/L of selenium could significantly inhibit the growth of mycelium.In the cultivation mode，10～600 mg/kg of selenium in the cultivation substrate did not affect the growth of mycelia，and the selenium content in the fruiting body increased with the increase of selenium concentration in the cultivation substrate.Selenium speciation analysis of fruiting bodies showed that selenium enriched was in the form of selenomethionine，methylselenocysteine，selenocystine and selenite，among which，selenomethionine was the main form of combination of selenium and amino acids.

Keywords：Pleurotus eryngii;selenium tolerance;selenium species;selenium amino acid