沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單增李斯特菌選擇性共增菌培養(yǎng)基的研制

嚴禮 肖穩(wěn) 郭焜鵬 何娟 劉卓靈 余正

摘 要：目的：研制一種對沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）和單增李斯特菌（Listeria monocytogens）的選擇性共增菌培養(yǎng)基（SSSL培養(yǎng)基）。方法：挑選添加成分進行單因素試驗，確定SSSL培養(yǎng)基的成分及配比，采用平板計數(shù)法驗證SSSL培養(yǎng)基的增菌效果。結果：確立了SSSL培養(yǎng)基配方，目標菌在SSSL增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，菌體濃度都達到了105～10?6CFU/mL，而且抑制非目標菌的生長。結論：SSSL培養(yǎng)基能用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單增李斯特菌選擇性共增菌，可望與多種檢測方法聯(lián)用，以提高檢測率和準確性。

關鍵詞：沙門氏菌;金黃色葡萄球菌;志賀氏菌;單增李斯特菌;共增菌;選擇性培養(yǎng)基

食源性致病菌的污染是導致食品安全問題的重要因素[1]，食源性致病菌的快速檢出是有效預防和控制食源性疾病的關鍵點。沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）和單增李斯特菌（Listeria monocytogens）是常見的污染肉類、果蔬、海產品而引發(fā)致病的菌種，所以這4種常見食源性致病菌的快速檢出尤為重要和迫切[2]。這幾種食源性致病菌的檢測方法已經(jīng)得到確定，其中沙門氏菌的國家標準方法[3]檢出時間一般是6～7 d;金黃色葡萄球菌的國家標準方法[4]檢出時間一般是4～5 d;單增李斯特菌的國家標準方法[5]檢出時間一般是5～7 d;志賀氏菌的國家標準方法[6]檢出時間一般是4～6 d。多重PCR[7]、多重熒光PCR[8]、DNA微陣列雜交技術[9]、免疫微陣列技術[10]和生物傳感器[11]等一系列新技術新方法也逐步應用于微生物檢驗領域中，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測法和現(xiàn)代檢測技術都需要增菌過程，微生物培養(yǎng)基是富集多種目標菌而達到檢測限、縮短增菌時間和降低檢測背景復雜性的有效手段，更是實現(xiàn)各種檢測方法簡化，實現(xiàn)快檢和共檢的重要基礎。本研究旨在提供能夠培養(yǎng)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單增李斯特菌的選擇性共增菌培養(yǎng)基（SSSL培養(yǎng)基），這將能優(yōu)化4種食源性常見致病菌的傳統(tǒng)微生物檢測方法，也能更好地體現(xiàn)現(xiàn)代快速檢測方法的效率。

1?材料與方法

1.1?菌種

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，CMCC 47731）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC 41002）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，CMCC 51571）、單增李斯特菌（Listeria monocytogens，CMCC 34761）、大腸桿菌（Escherichia coli，CMCC 44102）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CMCC 20015）均為本實驗室保藏菌株;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，CMCC 63501）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus，CMCC63301）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC 10211），青島海博生物技術公司;小腸耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，CMCC 52225），中國醫(yī)學細菌保藏管理中心。

1.2?主要試劑與儀器

胰酪胨大豆肉湯（TSB），美國BD公司;麥芽提取物、蛋白胨，英國OXOID公司;谷氨酰胺，美國Thermo Fisher公司;牛肉浸膏、氯化鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、磷酸吡哆醛、維生素B?12，國藥集團化學試劑有限公司;氯化鋰、亞碲酸鉀、萘啶酮酸、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸鐵銨，上海君川科技有限公司。

THZ?103B恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學儀器有限公司;SPX?100B?Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份公司;UV?2550 紫外分光光度計，日本島津公司;FE28 pH計，瑞士梅特勒?托利多公司;TE124S 電子天平，德國賽多利斯公司。

1.3?SSSL培養(yǎng)基研制

1.3.1?共增菌基礎培養(yǎng)基配制?分別稱取胰酪蛋白胨肉湯30.0 g、麥芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、氯化鈉 10 g加入到1 000 mL蒸餾水中，混勻，調節(jié)pH值至7.3，滅菌后4℃保藏備用。

1.3.2?共增菌培養(yǎng)基添加成分及配比篩選?以共增菌基礎培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基，選取可能的抑制劑和促進劑：萘啶酮酸、氯化鋰、亞碲酸鉀、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鐵銨、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、維生素B?12作為添加劑成分。將4種目標菌分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，轉接2次后用無菌生理鹽水梯度稀釋，按照102 CFU/mL起始量逐一接種于分別添加了上述10種添加劑各3個水平的基礎培養(yǎng)基中，作為添加劑篩選組，以不含添加劑的共增菌基礎培養(yǎng)基為空白對照組，37℃培養(yǎng)24 h，測定A ?600nm值，計算抑制率。

1.4?營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）配制

分別稱取牛肉浸膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、氯化鈉5.0 g加入到1 000 mL蒸餾水中，混勻，調節(jié)pH值至7.4，滅菌后4℃保藏備用。

1.5?4種目標菌在SSSL培養(yǎng)基中生長效果驗證

按照102CFU/mL起始量，將4種目標菌分別接種到100 mL SSSL培養(yǎng)基及NB培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24 h。分別取4、8、12、16、20、24 h的培養(yǎng)物以平板計數(shù)瓊脂進行計數(shù)，平行試驗10次，NB培養(yǎng)基為對照組，對不同時間的菌體濃度進行對比。

1.6?SSSL培養(yǎng)基的選擇性驗證

按照102CFU/mL起始量，將4種目標菌和6種非目標菌接種于SSSL培養(yǎng)基及NB培養(yǎng)基中，分別在37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6、12 h，測定培養(yǎng)物的A ?600nm值，平行試驗10次，NB培養(yǎng)基為對照組，觀察目標菌與非目標菌的生長情況。

1.7?統(tǒng)計學分析

利用SPSS 22.0軟件對4種目標菌在SSSL培養(yǎng)基中及在NB培養(yǎng)基中的生長情況進行配對t檢驗，進行顯著性差異分析。

2?結果與分析

2.1?共增菌培養(yǎng)基添加成分及配比確定

表1結果顯示，氯化鋰隨著濃度的增加對福氏志賀氏菌和單增李斯特菌的抑制作用均加強，而腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長穩(wěn)定，故取氯化鋰的濃度為0.5 g/L。當亞碲酸鉀濃度為0.3 mg/mL時，腸炎沙門

氏菌、福氏志賀氏菌和單增李斯特菌的抑制率超過了50%，當亞碲酸鉀濃度為0.1 mg/mL和0.2 mg/mL時，對4種目標菌抑制作用都不明顯，且兩種濃度抑制率無明顯差異，考慮到亞碲酸鉀可抑制除凝固酶陽性葡萄球菌外多數(shù)細菌，故確定亞碲酸鉀濃度為0.2 mg/L。萘啶酮酸對腸炎沙門氏菌和福氏志賀氏菌抑制作用非常強烈，而檸檬酸鈉對金黃色葡萄球菌抑制作用非常強烈，故不考慮添加。當去氧膽酸鈉濃度為0.3 g/L時，對單增李斯特菌的抑制率超過了50%，當濃度為0.5 g/L時對黃金色葡萄球菌的抑制率超過了50%，當濃度為0.1 g/L時對4種目標菌都較為溫和。當檸檬酸鐵銨濃度為 1.0 g/L時，對志賀氏菌的抑制率超過了50%，當濃度為2.0 g/L時對金黃色葡萄球菌的抑制率超過了50%，故確定檸檬酸鐵銨添加濃度為0.5 g/L。丙酮酸鈉、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛和維生素B?12對目標菌增菌都有促進作用。丙酮酸鈉的促進作用隨著濃度的提高而提高;當谷氨酰胺濃度為1.0 g/L時，有一定的抑制作用，可能與谷氨酰胺降解產生過多的游離氨抑制微生物生長有關;磷酸吡哆醛隨著濃度的增加，促進作用無明顯增加;維生素B?12隨著濃度增加，促進作用變小，故確定丙酮酸鈉濃度為4.0 g/L、谷氨酰胺濃度為0.5 g/L、磷酸吡哆醛濃度為1.0 mg/L、維生素B?12濃度為1.0 mg/L。SSSL培養(yǎng)基配方確定為胰酪胨大豆肉湯30.0 g、麥芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、谷氨酰胺0.5 g、丙酮酸鈉4.0 g、磷酸吡哆醛1.0 mg、維生素B?121.0 mg、氯化鈉10 g、氯化鋰0.5 g、亞碲酸鉀0.2 mg、去氧膽酸鈉0.1 g、檸檬酸鐵銨0.5 g、蒸餾水1 000mL。

2.2?4種目標菌在SSSL培養(yǎng)基中生長效果的驗證

腸炎沙門氏菌在SSSL培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間點的增菌速度優(yōu)于NB培養(yǎng)基對照組，相比對照組增菌效果明顯，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且在20 h兩種培養(yǎng)基中的菌液濃度都達到了最高值（表2）。

福氏志賀氏菌相比NB培養(yǎng)基對照組有一定滯后性，整體落后于NB培養(yǎng)基對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但當增菌時間達到24 h時福氏志賀氏菌在兩種培養(yǎng)基中菌液濃度都達到了10?8CFU/mL，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。

金黃色葡萄球菌在兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h以后，每4 h增菌速度明顯優(yōu)于NB培養(yǎng)基對照組，且組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在SSSL培養(yǎng)16 h后達到菌液濃度最高值，比NB培養(yǎng)基提前了4 h，說明SSSL更有利于金黃色葡萄球菌生長（表4）。

單增李斯特菌在SSSL培養(yǎng)基培養(yǎng)與NB培養(yǎng)基對照組生長速度比較相似，但在4、12、16 h單增李斯特菌在SSSL培養(yǎng)基中增菌效果要低于對照組，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表5）。

2.3?SSSL培養(yǎng)基上選擇性增菌效果的驗證

腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均能在SSSL培養(yǎng)基中良好生長，生長情況略好于NB培養(yǎng)基對照組，同時非目標菌受到了抑制，其中蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌和小腸耶爾森菌完全不能生長，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌在培養(yǎng)6 h和12 h受到了強烈抑制，非目標菌濃度遠低于目標菌，降低了非目標菌對目標菌檢測的干擾。NB培養(yǎng)基為對照（表6）。

3?討論

微生物前增菌是影響微生物檢測的重要因素，而微生物培養(yǎng)基為微生物提供了生長所需的營養(yǎng)物質和適合的環(huán)境條件，所以國內不少學者已經(jīng)開展了對不同目標菌的增菌培養(yǎng)基研究，范媛媛等[12]對法國標準化協(xié)會推出的沙門氏快速檢測AFRON改良法所用到的SX2液體培養(yǎng)基進行了評價，鼠傷寒沙門氏菌的生長率達到了0.94，而非目標菌大腸埃希桿菌的最高濃度為3CFU/mL，SX2液體培養(yǎng)基能快速促進目標菌生長，又能明顯抑制非目標菌生長。趙廣英等[13]用多種蛋白胨和酵母浸膏作為促進副溶血性弧菌增長的添加成分，得到了新的副溶血性弧菌增菌培養(yǎng)基。李曉琍等[14]通過金黃色葡萄球菌在Baird?Parker瓊脂平板上生長效果評價對7.5%氯化鈉肉湯和10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯兩種增菌培養(yǎng)基進行了比較，發(fā)現(xiàn)10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯選擇性增菌效果更好。

本研究通過以改良的胰蛋白胨大豆肉湯為基礎培養(yǎng)基，添加了丙酮酸鈉、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、維生素B?12促進生長成分，4種目標菌在選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)8h后，菌體濃度能達到105～106 CFU/mL，培養(yǎng)12 h后，菌體濃度能達到107～108 CFU/mL。目標菌在SSSL培養(yǎng)基的生長速度總體上優(yōu)于在營養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基上，能滿足后續(xù)試驗檢測要求。同時為了較好地抑制背景微生物，添加了氯化鋰、亞碲酸鉀、去氧膽酸鈉和檸檬酸鐵銨使非目標菌表現(xiàn)為完全不能生長或生長受到抑制，保證了SSSL培養(yǎng)基的選擇性。

下一步可以探討微生物培養(yǎng)基對于菌體的損傷修復和抑菌成分的拮抗，因為食品中的微生物往往受到加工過程中高溫和低溫的損傷，殘留抗生素和抑菌化學成分的損傷，這些容易導致食源性致病微生物處于休克和假死狀態(tài)，導致檢測的檢不出或結果的假陰性[15]。今后可以考慮把菌體細胞壁損傷的修復和本課題專注的快速增菌和抑菌成分吸附兩個方面結合起來，從三個環(huán)節(jié)進行一體化研究，為食源性致病微生物各種檢測方法提供更簡便快捷的多場景通用型增菌培養(yǎng)基?！?/p>

參考文獻

[1]Huang Y R，Hsieh H S，Lin S Y，et al.Application of electrolyzed oxidizing water on the reduction of bacterial contamination for seafood[J].Food Control，2006，17（12）：987?993.

[2]陳小敏，楊華，桂國弘，等.2008—2015年全國食物中毒情況分析[J].食品安全導刊（科技文苑版），2017，25（35）：69?73.

[3]GB 4789.5—2016.食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，志賀氏菌檢驗[S].

[4]GB 4789.30—2016.食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].

[5]GB 4789.10—2016.食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，金黃色葡萄球菌檢驗[S].

[6]GB 4789.4—2016.食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，沙門氏菌檢驗[S].

[7]Xu Y G，Cui L C，Tian C Y，et al.A multiplex polymerase chain reaction coupled with high?performance liquid chromatography assay for simultaneous detection of six foodborne pathogens[J].Food Control，2012（25）：778?783.

[8]Oscar F D，Palmiro P，Santo M，et al.A fi ltration?based realtime PCR method for the quantitative detection of viable Salmonella enterica and Listeria monocytogenes in food samples[J].Food Microbiology，2009（26）：311?316.

[9]Chiang Y C，Yang C Y，Li C，et al.Identification of Bacillus spp.，Escherichia coli，Salmonella spp.，Staphylococcus spp.?and Vibrio spp.with 16S ribosomal DNA?based oligonucleotide array hybridization[J].Int Food Microbiol，2006（107）：131?137.

[10]Chen C S，Durst R A.Simultaneous detection of Escherichia coli O157：H7，Salmonella spp.and Listeria monocy to SSSL nes with an arraybased immunosorbent assay using universal protein G?liposomal nanovesicles[J].Talanta，2006（69）：232?238.

[11]Zhang J，Li Z J，Zhang H Y，et al.Rapid detection of several foodbornepathogens by FoF1?ATPase molecular motor biosensor[J].J Microbiol Met，2013，93（1）：37?41.

[12]范媛媛，鄭冰，王樹祥，等.一種新型培養(yǎng)基在沙門氏菌 檢測中的效果評價[J].食品工業(yè)科技，2011，8（8）：415?417.

[13]趙廣英，申科敏，勵建榮.副溶血性弧菌增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的改進[J].水產科學，2010，29（3）：137?141.

[14]李曉琍，楊祖順，范璐，等.食品中金黃色葡萄球菌2種增菌液增菌效果的試驗觀察研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25（3）：353?355.

[15]王虎虎，徐幸蓮.冰鮮雞肉中致病菌三重PCR檢測方法的建立[J].中國農業(yè)科學，2010，43（17）：3608?3615.

[16]肖穩(wěn)，張海韻，楊滔，等.羧甲基殼聚糖?分子信標?金納米生物傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌[J].中國食物與營養(yǎng)，2019，25（9）：33?36.

Preparation of Selective Co?enrichment Medium for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes

YAN Li1，XIAO Wen1，GUO Kun?peng1，HE Juan1，LIU Zhuo?ling2，YU Zheng2

（1 Hunan Institute of Food Quality Supervision and Inspection，Changsha 410117，China;2 Cooperative Innovation Center of Jiangnan University，Wuxi 214100，China）

Abstract：?Objective To develop a selective co?culture medium（SSSL）for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogens. Method Single factor experiments were conducted to determine the composition and proportion of SSSL medium，and plate counting method was used to verify the bacteriostasis effect of SSSL medium. Result The SSSL medium formulation was established.After 8 hours of culture in SSSL medium，the concentration of target bacteria reached 105～106 CFU/mL，and the growth of non?target bacteria was inhibited. Conclusion SSSL medium can be used for selective co?growth of Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes.It is expected that SSSL medium can be combined with various detection methods to improve the detection rate and accuracy.

Keywords：Salmonella;Staphylococcus aureus;Shigella;Listeria monocytogenes;co?enriched;selective medium