液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)及其加工品中孔雀石綠

于宙 谷小鳳 丁白瑜

摘要：建立了水產(chǎn)及其加工品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定方法。簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，省略液液萃取，減少固相萃取柱。樣品采用經(jīng)酸化乙腈提取，中性氧化鋁粉分散固相萃取與陽離子交換柱凈化，優(yōu)化了陽離子交換柱淋洗液和洗脫液，經(jīng)液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。方法的檢出限0.2 μg/kg，定量限0.5 μg/kg，線性范圍0.5～20.0 ng/mL，在0.5～2.0 μg/kg加標(biāo)水平下孔雀石綠和無色孔雀石綠平均回收率分別為94.2%和92.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。該方法適用于水產(chǎn)及其加工品中孔雀石綠殘留的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠;無色孔雀石綠;水產(chǎn)及其加工品;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：O657.63? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.050

Abstract：A method of malachite green and leucomalachite green for the determination by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）in aquatic products and their processed products was established. The sample pretreatment was simplified，the extraction was eliminated，one step of solid phase extraction was reduced，the cationic exchange elution solution and elution solution were optimized. Pretreatment improved to extract by acidified acetonitrile，the extractive compound purified by dispersive solid phase extraction and MCX solid phase extraction column，separated by liquid chromatography，determined by mass spectrometry，and quantified by internal standard. The detection limit of the method 0.2 μg/kg，the quantification limit 0.5 μg/kg，and the linear rang 0.5～20.0 ng/mL. The average recoveries of MG and LMG at 0.5～2.0 μg/kg were 94.2% and 92.0%，relative standard deviations were less than 5%. The method was suitable for the determination of malachite green residues in aquatic products and processed products.

Key words：malachite green（MG）;leucomalachite green（LMG）;aquatic products and processed products;liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）既是染料，也是殺真菌、細(xì)菌、寄生蟲的藥物，可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，但長(zhǎng)期超量使用有潛在的致癌、致畸、致突變的作用[1]。孔雀石綠進(jìn)入水生動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)快速代謝成脂溶性的無色（隱色）孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG）[2]。無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域國(guó)家明令禁止添加，在養(yǎng)殖業(yè)中的使用未得到美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）的認(rèn)可;根據(jù)歐盟法案2002/675/EC[3]的規(guī)定，動(dòng)物源性食品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留總量限制? 2 μg/kg;日本的“食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度（Positive List System）”規(guī)定在進(jìn)口水產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠殘留;我國(guó)在農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY 5071—2002 無公害食品魚藥使用準(zhǔn)則》中也將孔雀石綠列為不得使用的禁用藥物。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》中規(guī)定孔雀石綠原料藥及其單方、復(fù)方制劑產(chǎn)品于2002年? ?4月15日一律停止使用。由于沒有價(jià)格低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。使用了含有MG與LMG原料的加工水產(chǎn)品如魚片、干海參等也會(huì)含有殘留物。每年由于孔雀石綠藥物殘留造成的退貨和銷毀事件，給企業(yè)造成巨大損失[4]。

水產(chǎn)及其加工品中含有較多脂肪等雜質(zhì)，特別是水產(chǎn)加工品經(jīng)過預(yù)處理、調(diào)味、干燥、烘烤等步驟，引入了食鹽、味精、淀粉等調(diào)味料，基質(zhì)更加復(fù)雜，凈化提取困難，干擾MG、LMG的測(cè)定?，F(xiàn)有測(cè)定方法有液相色譜法[5-8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜? ?法[9-18]、酶聯(lián)免疫法[19]、電化學(xué)法[20-21]和離子阱質(zhì)譜[22]等，其中應(yīng)用最為廣泛的是液相色譜法與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法采用溶劑提取、液液萃取和固相萃取柱凈化，將MG用硼氫化鉀還原為代謝產(chǎn)物L(fēng)MG用熒光檢測(cè)器檢測(cè);或以二氧化鉛柱后衍生將LMG氧化為MG，以紫外或二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定總量。相比液相色譜法，LC-MS/MS具有專屬性好、干擾少、靈敏度高和避免假陽性等優(yōu)點(diǎn)，在定性與定量檢測(cè)中表現(xiàn)良好，是簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法。

目前LC-MS/MS測(cè)定MG、LMG時(shí)存在以下缺點(diǎn)：一是液液萃取難分層;二是萃取液濃縮時(shí)目標(biāo)化合物損失嚴(yán)重;三是陽離子交換柱凈化時(shí)洗脫效果不佳，回收率較低。針對(duì)以上問題，試驗(yàn)改善了前處理方法，省去液液萃取、選擇中性氧化鋁粉分散固相萃取、優(yōu)化陽離子交換柱淋洗及洗脫液[13，22]，顯著降低目標(biāo)物損失。

1? ?試驗(yàn)部分

1.1? ?儀器與試劑

乙腈、甲醇、甲酸，色譜純，Honeywell霍尼韋爾公司提供;氨水、無水乙酸銨，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;超純水（18.2MΩ），ELGA超純水機(jī)，威立雅水處理技術(shù)有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、同位素內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠（D5-MG）、氘代隱色孔雀石綠（D6-LMG），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供。

5 mmol/L乙酸銨：稱取0.385 0 g無水乙酸銨溶于1 000 mL水中，以冰乙酸調(diào)pH值到4.5，過0.2 μm濾膜;酸化乙腈：冰乙酸+乙腈= 2+98;甲酸溶液：加酸+水= 2+98;氨水甲醇：氨水+甲醇= 5+95。

Waters Xevo TQ-S 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，沃特世公司提供。

XHF型均質(zhì)器，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品;3-30K型離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品;DC型氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品;VOKTEX型渦旋混勻器，海門市貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;12位SPE型固相萃取裝置，德國(guó)CNW公司產(chǎn)品。

MCX陽離子交換柱：60 mg/3 mL，使用前依次以乙腈3 mL和2%甲酸溶液3 mL活化。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?工作曲線

稱取適量MG，LMG，D5-MG，D6-LMG，以乙腈溶解配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，臨用前以乙腈稀釋為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液。分別吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液，以5 mmol/L乙酸銨+乙腈=1+1稀釋為MG，LMG質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的工作液，該工作液中D5-MG，D6-LMG質(zhì)量濃度均為2.0 ng/mL。

1.2.2? ?前處理方法

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，添加100 μL內(nèi)標(biāo)中間液，加入12 mL酸化乙腈，均質(zhì)30 s，另取10 mL酸化乙腈清洗均質(zhì)刀頭，超聲提取3 min，離心后轉(zhuǎn)移上清液，將清洗刀頭的清洗液移入離心沉淀，渦旋分散殘?jiān)?，超聲提? min，離心后合并2次上清液。加入2g中性氧化鋁粉，渦旋混勻并靜置，過濾掉氧化鋁粉。鮮活水產(chǎn)品定容至25 mL，取5 mL以初始流動(dòng)相定容至1 mL，過膜待測(cè);水產(chǎn)加工品通過陽離子交換柱，以5 mL酸化乙腈淋洗，棄去流出液，5 mL氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，以初始流動(dòng)相定容至5 mL，過膜待測(cè)。

1.2.3? ?色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱， 1.7 μm，2.1×50 mm;進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨與乙腈。

梯度程序見表1。

1.2.4? ?質(zhì)譜條件

電噴霧電離源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，毛細(xì)管電壓0.6 V，源補(bǔ)償電壓50 V，脫溶劑氣流量1 000 mL/min，錐孔氣流量150 mL/min，碰撞氣流速0.15 mL/min。

質(zhì)譜條件見表2。

1.2.5? ?測(cè)定

內(nèi)標(biāo)法定量。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?條件優(yōu)化

2.1.1? ?前處理方法優(yōu)化

前處理中，酸性提取液能促進(jìn)目標(biāo)化合物的溶解，若加入緩沖鹽、離子對(duì)試劑，需使用二氯甲烷溶液萃取凈化。水與二氯甲烷屬于共軛溶液，較長(zhǎng)時(shí)間離心才能分層，且萃取后的溶液體積較大，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時(shí)，MG和LMG損失嚴(yán)重。以冰乙酸酸化的乙腈提取，使用氧化鋁粉吸附脂肪，為避免堿性和酸性氧化鋁對(duì)目標(biāo)化合物吸附，選擇中性氧化鋁粉分散固相萃取。三苯甲烷類屬于弱堿性物質(zhì)，針對(duì)水產(chǎn)加工品增加陽離子交換柱進(jìn)一步凈化。陽離子交換小柱要求上樣溶液、淋洗溶液、洗脫溶液pka值應(yīng)逐級(jí)升高，且pH值相差2以上，嘗試不同的淋洗和洗脫溶液，選擇酸化乙腈、氨水甲醇溶液時(shí)，目標(biāo)化合物損失最小。

2.1.2? ?色譜條件

目標(biāo)化合物在反相C18色譜柱上有保留，在乙腈中易溶，乙酸銨作為緩沖溶液提供合適的pH值并促進(jìn)生成正離子，因此選擇5 mmol/L乙酸銨與乙腈作為流動(dòng)相。在梯度洗脫流速0.3 mL/min時(shí)，化合物有效分離，峰型較好，保留時(shí)間穩(wěn)定，分析時(shí)間短，且基線穩(wěn)定干擾少。

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖見圖1。

2.1.3 質(zhì)譜條件

目標(biāo)化合物氫鍵供體數(shù)量為4，易形成M+1型分子離子峰，因此采用ESI+模式。首先通過母離子掃描得到MG，LMG，D5-MG，D6-LMG的質(zhì)荷比分別為329，331，334，337 m/z，再通過子離子掃描得到離子碎片，選擇最強(qiáng)豐度作為定量子離子，干擾較小離子作為定性子離子，確定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的離子對(duì)。

2.2? ?檢出限與定量限

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比S/N作為檢出限，10倍信噪比為定量限。確定方法的檢出限0.2 μg/kg，定量限0.5 μg/kg。

信噪比見圖2。

2.3? ?回收率與精密度

選取21批魚、魚片和干海參等樣品，按水產(chǎn)和加工品分成兩類，每類3種，取可食部分，混勻制樣，加入不同質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液作為加標(biāo)樣品。每個(gè)樣品測(cè)定6次，同時(shí)測(cè)定空白樣品，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。離子化效率高，基線噪音低。

回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

3? ?結(jié)論

建立了LC-MS/MS測(cè)定水產(chǎn)及其加工品中MG，LMG殘留量的方法。簡(jiǎn)化前處理步驟，選取合適的提取溶液直接提取，分散固相萃取代替固相萃取柱提純，陽離子交換柱進(jìn)一步凈化，根據(jù)質(zhì)譜分析優(yōu)化選出酸化乙腈和氨水甲醇溶液為最佳的淋洗和洗脫液。該方法具有回收率高、精密度好、檢出限低、干擾小、適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，能夠快速、準(zhǔn)確地獲得分析效果。

參考文獻(xiàn)：

Raoul V Kuiper，Peter Scherpenisse，Aldert A. Bergwerff. Persistence of residues of malachite green in European eel（Anguilla）after water-borne exposure of juvenile eels[J]. Aquaculture，2004（1）：55-63.

陳永平，張素青，李春青，等. 不同水產(chǎn)品中有色和無色孔雀石綠的降解動(dòng)力學(xué)研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013（1）：183-188.

Commission Decision 2002/267/EC. Implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[S]. The Commission of European Communites，2002.

魏建華，蔡穎，林文華，等. 出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留狀況及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)測(cè)[J]. 食品研究與開發(fā)，2012，33（4）：158-160.

宮向紅，徐英江，任傳博，等. HPLC測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠、亞甲基藍(lán)、結(jié)晶紫及其代謝物的殘留量[J]. 食品科學(xué)，2012，33（4）：144-147.

王靜，楊洪生，張美琴，等. 高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠代謝物殘留量[J]. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2010，46（6）：642-647.

陳永平，張素青，李春青，等. 高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量方法的改進(jìn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32 （11）：80-84.

Zhu Chengyun，Wei Jie，Dong Xuefang，et al. Fast analysis of malachite green，leucomalachite green，crystal violet and leucocrystal violet in fish tissue based on a modified QuEChERS procedure[J]. Chinese Journal of Chromatography，2014，32（4）：419-425.

田秀慧，于召?gòu)?qiáng)，陳瑋，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)苗種中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠[J]. 食品科學(xué)，2013，34（12）：171-177.

王旭峰，王強(qiáng)，趙東豪，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水和沉積物中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留[J]. 分析試驗(yàn)室，2015，34（6）：702-706.

周貽兵，吳坤，劉利亞，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2013，34（5）：294-298.

梅光明，郭遠(yuǎn)明，陳雪昌，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚粉中孔雀石綠[J]. 分析試驗(yàn)室，2013，32（8）：73-76.

張藝蓓，岳田利，喬海鷗，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物[J]. 食品科學(xué)，2014，35（10）：179-184.

張貞理，張平，申大忠. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)調(diào)味品中的羅丹明B、結(jié)晶紫和孔雀石綠[J]. 分析化學(xué)，2012，40（3）：487-488.

朱寬正，王鵬，林雁飛，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品種孔雀石綠、結(jié)晶紫以及它們的隱色代謝物殘留[J].色譜，2007，25（1）：66-69.

Arroyo David，Ortiz M Cruz，Sarabia Luis A，et al. Determination and identification，according to European Union Decision 2002/657/EC，of malachite green and its metabolite in fish by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using an optimized extraction procedure and three-way calibration[J]. Journal of Chromatography A，2009（29）：5 472-5 482.

Wendy C Andersen，Sherri B Turnipseed，José E Roybal. Quantitative and Confirmatory Analyses of Malachite Green and Leucomalachite Green Residues in Fish and Shrimp[J]. U.S. FDA，2005，21（11）：1 247-1 253.

Gomez Perez Maria Luz，Romero-Gonzalez Roberto，Martinez Vidal Jose Luis，et al. Analysis of veterinary drug residues in cheese by ultra-high-performance LC coupled to triple quadrupole MS/MS[J]. Journal of Separation Science，2013，36（7）：1 223-1 230.

謝煥龍，王宇，徐振林，等. 基于混合抗體的酶聯(lián)免疫分析方法同時(shí)檢測(cè)孔雀石綠和隱孔雀石綠[J]. 現(xiàn)代食品科技，2015，31（12）：325-330.

Hongchao Yi，Wanyun Qu，Wensheng Huang. Electrochemical determination of malachite green using a multi-wall carbon nanotube modified glassy carbon electrode[J]. Microchimica Acta，2008（1）：291-296.

Guo Zhiyong，Gai Panpan，Hao Tingting，et al. Determination of malachite green residues in fish using a highly sensitive electrochemiluminescence method combined with molecularly imprinted solid phase extraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011（2）：5 257-5 262.

金雁，劉寧，姚家彪，等. 高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量[J]. 現(xiàn)代儀器，2006，12（3）：52-54. ◇