響應(yīng)面法優(yōu)化梔子中梔子苷的純化工藝

陳婕 鄧愛(ài)華 劉聃

摘要：采用正丁醇有機(jī)溶劑萃取法分離梔子中的梔子苷，考查萃取時(shí)間、萃取溫度、梔子苷質(zhì)量濃度、相比和pH值對(duì)梔子苷萃取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素和水平，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，擬合試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的多元二次方程，對(duì)各個(gè)因素的顯著性及交互作用進(jìn)行分析，運(yùn)用Design Expert 8.0.6優(yōu)化試驗(yàn)條件。得到最佳工藝參數(shù)為萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45 ℃，梔子苷質(zhì)量濃度3.0 mg/mL，相比為 0.5∶1，pH值7.0，梔子苷萃取率為30.27%。

關(guān)鍵詞：梔子;梔子苷;正丁醇;萃取;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TQ461? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.046

Abstract：The extraction time，extraction temperature，geniposide concentration，volume ratio of n-butanol to solution and pH of the butanol extract of geniposide were analyzed. The effect of selected test factors and levels on the basis of single factors experiment，according to the central composite experimental design，3 factors and 3 levels of response surface analysis multivariate quadratic equantion，fitting the experimental factors and response value，was analysized and the interaction of various factors，the optimum process parameters obtained by organic solvent extraction process under the condition of Design Expert 8.0.6 optimization，the extraction time 30 min，extraction temperature 45 ℃，gardenoside concentration 3.0 mg/mL，volume ratio of n-butanol to solution 0.5∶1 and pH 7.0. Under this condition，the extraction rate of geniposide was 30.27%.

Key words：Gardenia jasminoides Ellis;geniposide;n-butanol;extract;response surface methodology

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）中梔子苷含量可達(dá)10.4 mg/g[1]，其廣泛用于改善睡眠[2]、清熱瀉火[3]、保肝利膽[4]等藥物的開發(fā)。試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化正丁醇萃取法純化梔子苷的影響因素，并對(duì)各個(gè)因素的顯著性及交互作用進(jìn)行分析，以期為梔子中梔子苷的工業(yè)化分離提供理論依據(jù)和生產(chǎn)指導(dǎo)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與儀器

梔子果，澧縣扶農(nóng)中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社提供;梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品，北京盛世康普化工技術(shù)研究院提供;甲醇（AR）、正丁醇（AR），湖南匯虹試劑有限公司提供。

PHS-25型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TDL-40B型高速離心機(jī)，上海安寧科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;UV-1800型紫外分光光度計(jì)，長(zhǎng)沙市天恒儀器有限公司產(chǎn)品;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品;HJ-6型磁力加熱攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠產(chǎn)品;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2? ?試驗(yàn)方法

稱取梔子干果適量，粉碎過(guò)40目篩，石油醚脫脂，按料液比1∶20加入50%甲醇水溶液，在超聲頻率40 kHz，超聲功率150 W下提取30 min，浸提3次，合并濾液過(guò)濾、真空濃縮得到梔子浸膏。取梔子浸膏溶于水配置不同濃度的梔子苷水溶液，再加入一定比例的正丁醇，萃取一定的時(shí)間后靜置分相，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)梔子苷的萃取率。

1.3? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1? ?梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取15 mg梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100 mL，配制0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別吸取0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL母液，加入甲醇定容至50 mL，得到1.5，3.0，6.0，12.0，18.0，24.0 μg/mL梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。以甲醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)238 nm處測(cè)吸光度。以梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）、吸光度為縱坐標(biāo)（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得梔子苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0173C+0.13，R2=0.999 9，R2接近于1，結(jié)果表明梔子苷質(zhì)量濃度在1.5～? ? 24.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.2? ?單因素試驗(yàn)

配制一定質(zhì)量濃度的梔子苷水溶液，加入正丁醇萃取。分別考查萃取時(shí)間（10，20，30，40，50 min）、萃取溫度（15，25，35，45，55 ℃）、梔子苷質(zhì)量濃度（2，4，6，8，10 mg/mL）、正丁醇/水溶液體積比（0.50∶1，0.75∶1，1.00∶1，1.25∶1，1.50∶1）、pH值（3.0，5.0，7.0，9.0，11.0）等對(duì)梔子苷萃取率的影響。

1.3.3? ?響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取萃取溫度、梔子苷質(zhì)量濃度、正丁醇/水溶液體積比為考查因素，以梔子苷萃取率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?單因素試驗(yàn)

2.1.1? ?萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響見圖1。

由圖1可知，萃取率隨萃取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。隨著萃取時(shí)間的增加，梔子苷逐漸富集到有機(jī)相中，梔子苷的萃取率不斷增大。由于正丁醇在上相易揮發(fā)，如萃取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，正丁醇體積減少，更多雜質(zhì)進(jìn)入正丁醇相，導(dǎo)致梔子苷萃取率下降，選擇萃取時(shí)間為30 min。

2.1.2? ?萃取溫度對(duì)萃取率的影響

萃取溫度對(duì)萃取率的影響見圖2。

由圖2可知，萃取率隨萃取溫度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。萃取溫度的增加會(huì)提高溶質(zhì)的傳質(zhì)效率，提高萃取率，同時(shí)也會(huì)加快正丁醇的揮發(fā)速度，降低正丁醇量，選擇萃取溫度為45 ℃。

2.1.3? ?梔子苷質(zhì)量濃度對(duì)萃取率的影響

梔子苷質(zhì)量濃度對(duì)萃取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著梔子苷質(zhì)量濃度增大，梔子苷萃取率增加。當(dāng)正丁醇相中溶解的梔子苷達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，繼續(xù)增加梔子苷質(zhì)量濃度，反而導(dǎo)致萃取率下降，選擇梔子苷質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

2.1.4? ?相比對(duì)萃取率的影響

相比對(duì)萃取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著正丁醇/梔子水溶液體積比的增加，萃取率先增加后降低。正丁醇質(zhì)量濃度的增加，體系的極性發(fā)生改變，根據(jù)相似相溶原理，梔子苷萃取率在一定范圍內(nèi)增加，選擇相比為0.5∶1。

2.1.5? ?pH值對(duì)萃取率的影響

pH值對(duì)萃取率的影響見圖5。

由圖5可知，隨著pH值的增大，萃取率緩慢下降，但整體影響不明顯。為了減少雜質(zhì)離子的引入，選擇pH值為7.0。

2.2? ?Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

使用Design Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程方差分析結(jié)果表3。對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合后，得相比（A）、萃取溫度（B）和梔子苷質(zhì)量濃度（C）對(duì)梔子苷萃取率的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=29.46-0.30A+0.25B-2.05C-0.64AB+2.66AC-

0.71BC-3.67A2-2.97B2-2.28C2.

方差分析顯示模型顯著（p<0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p>0.05），因此模型成立。從表3可知，一次項(xiàng)C、交互相AC及二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)萃取率的影響非常顯著（p<0.001）;交互相AB、BC對(duì)萃取率的影響極顯著（p<0.01）;一次項(xiàng)A，B對(duì)萃取率的影響顯著（p<0.05）;由F值可知，在所選試驗(yàn)范圍內(nèi)，A（相比）、B（萃取溫度）和C（梔子苷質(zhì)量濃度）對(duì)萃取率的影響順序?yàn)镃（梔子苷質(zhì)量濃度）> A（相比）> B（萃取溫度）。

2.3? ?響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

交互作用對(duì)萃取率影響響應(yīng)面圖見圖6。

對(duì)比曲面陡峭程度，發(fā)現(xiàn)與方差分析結(jié)果一致，梔子苷質(zhì)量濃度與相比之間存在非常顯著的交互作用，相比與萃取溫度、萃取溫度與梔子苷質(zhì)量濃度之間存在顯著的交互作用。

2.4? ?最優(yōu)萃取工藝條件的確定

利用Design Expert 8.0.6軟件由所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出最佳萃取工藝條件為萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45.93 ℃，梔子苷質(zhì)量濃度2.68 mg/mL，相比0.398∶1，pH值7.0，預(yù)測(cè)梔子苷萃取率為30.18%。為了適合實(shí)際操作，調(diào)整條件萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45 ℃，梔子苷質(zhì)量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，通過(guò)3組平行試驗(yàn)，梔子苷萃取率平均值為30.27%±0.08%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異（p>0.05）。證明此條件為梔子苷萃取的最優(yōu)條件，該回歸方程可用于實(shí)踐。

3? ?結(jié)論

以脫脂及甲醇超聲提取獲得梔子提取物為原料，經(jīng)正丁醇萃取富集梔子苷。通過(guò)響應(yīng)面法獲得最優(yōu)萃取工藝參數(shù)為萃取時(shí)間30 min，萃取溫度45 ℃，梔子苷質(zhì)量濃度3.0 mg/mL，相比0.5∶1，pH值7.0，在此條件下，梔子苷萃取率為30.27%，與預(yù)測(cè)值30.18%無(wú)顯著性差異（p>0.05）。通過(guò)正丁醇萃取富集梔子醇提取物中梔子苷，將為梔子的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

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