超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中多獸藥殘留

楊兆甜， 吳亞婕， 王 瑩， 王雅靜， 呂青骎，2， 王 瑋*，2

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院， 江蘇 南京210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京），江蘇 南京210095）

目前，我國(guó)在畜牧養(yǎng)殖方面使用較多的獸藥有β-受體激動(dòng)劑類、磺胺類、砜類抑制劑類以及喹諾酮類等[1-2]。 獸藥的濫用易使畜牧產(chǎn)品遭受嚴(yán)重污染[3]，藥品經(jīng)代謝進(jìn)入動(dòng)物源性食品中，之后可通過食物鏈在人體蓄積， 不僅能使人體產(chǎn)生抗藥性、引起過敏反應(yīng)、影響腸道內(nèi)菌群[4]，還能導(dǎo)致中毒等不良反應(yīng)[5-6]。 因而，動(dòng)物源性食品的獸藥殘留問題引起了廣泛關(guān)注[7-9]。

目前，動(dòng)物源性食品獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法 （Capillary Electrophoresis，CE）[10]、高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11-12]、免疫法（Immunoassay，IA）[13-14]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （Ultra Performance Liquid Chromatography/tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[15-16]等。 其中，CE 法可高效分離化合物，但重現(xiàn)效果不理想[17]；HPLC 法檢測(cè)快速、價(jià)格較低，但靈敏度較差[18-19]；IA 法檢測(cè)快速、靈敏，但假陽(yáng)性率偏高[20]。 而且以上方法大多按照獸藥種類分成若干種[21-22]，檢測(cè)效率較低，且獸藥高通量同時(shí)檢測(cè)分析受制于缺乏統(tǒng)一的前處理方法難以實(shí)現(xiàn)[23-24]。作者在采用Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱凈化和提取藥物的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化前處理方法，建立了一種高通量快速測(cè)定豬肉中20種獸藥殘留的UPLC-MS/MS 方法。 該方法可以彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)方法的缺陷，旨在為我國(guó)動(dòng)物源性食品安全監(jiān)測(cè)體系建設(shè)、國(guó)際貿(mào)易中藥物殘留檢測(cè)提供技術(shù)保障，同時(shí)有助于提高我國(guó)動(dòng)物源食品的安全性，維護(hù)我國(guó)消費(fèi)者的權(quán)益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與材料

advance EDI 純水儀： 購(gòu)于德國(guó)Sartorius 公司；I-class & Xevo TQ-S Micro型超高效液相色譜質(zhì)譜儀： 購(gòu)于美國(guó)Waters 公司；N-EvAP型24 管氮吹儀： 購(gòu)于美國(guó)Organomation 公司；D-16C 高速冷凍離心機(jī)：購(gòu)于德國(guó)Sartorius 公司；Oasis PRiME HLB小柱：購(gòu)于美國(guó)Waters 公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)材料為市售生鮮豬肉，購(gòu)于江蘇省南京市超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)品：沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、克倫特羅、妥布特羅、氯丙那林、磺胺甲惡唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、氨苯砜、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、培氟沙星、地塞米松、替米考星、紅霉素、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D3、特布他林-D9、克倫特羅-D9、妥布特羅-D9、氯丙那林-D7、恩諾沙星-D5：購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）：購(gòu)于美國(guó)Fisher 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理準(zhǔn)確稱取生鮮豬肉樣品制得的肉糜2.50 g，將其放置于50 mL 離心管中，依次加入20 μL 內(nèi)標(biāo)混合工作液和10 mL 體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液， 渦旋振蕩1 min， 超聲提取3 min，10000 r/min 離心5 min，獲取上清液。 在固相萃取裝置上放置Oasis PRiME HLB 小柱， 取5 mL上清液加載到固相萃取柱，收集過濾液。 并取4 mL濾液在50 ℃水浴的條件下用氮?dú)獯蹈?，?jīng)1 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇水溶液復(fù)溶后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，復(fù)溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。 采用陰性樣品參照上述步驟進(jìn)行空白試驗(yàn)；在陰性樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并參照上述步驟進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制單標(biāo)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取20種待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶液作為溶劑，配制為一定質(zhì)量濃度（20～100 μg/mL）的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

6 類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制： 分別取同類別中一定量的單標(biāo)儲(chǔ)備液并用甲醇定容，使6 類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為10.00 μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別移取6 類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，并用甲醇溶液定容至10.00 mL，得到1.00 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：各種內(nèi)標(biāo)以甲醇溶液為溶劑配制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液； 分別移取各種內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1.00 mL， 用甲醇溶液定容至10.00 mL，得到1.00 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)混合溶液。

1.3.3 UPLC-MS/MS 法的建立色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；以體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液和體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相；流速保持在0.3 mL/min；柱溫保持在30℃；進(jìn)樣量為10 μL；色譜柱的洗脫方式采用梯度洗脫，其梯度洗脫條件如表1 所示。

質(zhì)譜條件： 電噴霧正離子模式（electrospray ionization in positive mode，ESI＋）； 掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；脫溶劑氣流量為1000 L/h；錐孔氣流量為20 L/h；離子源溫度保持在500 ℃。 監(jiān)測(cè)參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

1.3.4 檢出限、定量限以及線性范圍的確定參照1.3.3 的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ）。 在豬肉空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，從而建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0.5～20 μg/kg，共設(shè)定6個(gè)點(diǎn)， 以豐度較強(qiáng)的子離子進(jìn)行定量分析，豐度次之的子離子進(jìn)行定性分析，以質(zhì)譜圖峰面積與藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系作圖，橫坐標(biāo)（X）為藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/kg），縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 其中，β-受體激動(dòng)劑類和喹諾酮類獸藥采用內(nèi)標(biāo)法確定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其他種類獸藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用外標(biāo)法進(jìn)行確定。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)在陰性生鮮豬肉制成的肉糜中分別添加1、5 μg/kg 和10 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)6個(gè)平行。 以平均回收率（recovery）計(jì)算結(jié)果評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，根據(jù)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （Relative Standard Deviation，RSD）評(píng)價(jià)該方法的精密度。

表2 20種獸藥質(zhì)譜條件Table 2 MS parameters of 20 kinds of veterinary drugs

1.3.6 方法的實(shí)際應(yīng)用選用市售生鮮豬肉樣品10 份，其中5 份采購(gòu)自超市，5 份采購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，參照1.3.1 和1.3.3 進(jìn)行樣品前處理和上機(jī)測(cè)定，以驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

參考相關(guān)文獻(xiàn)，提取多獸藥殘留時(shí)普遍使用乙腈、甲醇等溶液或者乙腈、甲醇和一定比例其他溶液混合用作提取液。 作者比較了體積分?jǐn)?shù)1%乙酸乙腈、 體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-80%乙腈水和體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí)的回收率（加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 μg/kg）。 表3 表明：選用體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí)，20種藥物的回收率均在60%～120%； 以體積分?jǐn)?shù)1%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑時(shí)，僅有7種藥物的回收率在60%～120%；而體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸-80%乙腈水作為提取溶劑時(shí)，僅有8種藥物的回收率在60%～120%，測(cè)定準(zhǔn)確性較低。 因此，選用體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈水作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑加標(biāo)回收率的比較Table 3 Comparison of spiked recovery with different extracting solutions

2.2 復(fù)溶溶劑的確定

在氮吹完成后進(jìn)行復(fù)溶操作時(shí)，復(fù)溶溶劑的選擇會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度與精密度。 作者在以體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水作為提取溶劑的基礎(chǔ)上，比較體積分?jǐn)?shù)10%甲醇水、 體積分?jǐn)?shù)15%乙腈水和體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-50%乙腈水溶液分別用作復(fù)溶溶劑時(shí)的回收率（加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 μg/kg）。表4 表明：當(dāng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醇溶液作為復(fù)溶溶劑時(shí)，所有藥物的回收率均在60%～120%之間；在體積分?jǐn)?shù)15%乙腈溶液用作復(fù)溶溶劑時(shí)， 有10種藥物的回收率位于該范圍內(nèi)； 而使用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-50%乙腈溶液復(fù)溶時(shí)，僅有9種藥物的回收率位于該范圍內(nèi)。因此，選擇體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶液作為復(fù)溶溶劑。

表4 不同復(fù)溶溶劑加標(biāo)回收率的比較Table 4 Comparison of spiked recovery with different dissolving solutions

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

本試驗(yàn)中喹諾酮類和β-受體激動(dòng)劑類獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用內(nèi)標(biāo)法繪制，其他種類獸藥標(biāo)準(zhǔn)曲線均采用外標(biāo)法進(jìn)行繪制，20種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、 檢出限以及定量限見表5。 20種藥物在0.5～20 μg/kg 內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系， 其r 值均大于0.995。 檢測(cè)的20種藥物中，18種藥物的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.7 μg/kg；其余2種藥物（地塞米松和替米考星） 的檢出限分別為1μg/kg 和5 μg/kg，定量限分別是3.3 μg/kg 和16.7 μg/kg。

2.4 方法精密度與準(zhǔn)確度

分別在陰性豬肉糜中添加1、5、10 μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用UPLC-MS/MS 檢測(cè)以確定樣品中獸藥殘留的回收率及RSD，且每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)6個(gè)平行。 表6 表明：20種獸藥3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均回收率在62.1%～118.3%，RSD 位于0.4%～16.7%之間。

2.5 方法實(shí)際應(yīng)用結(jié)果

選用10 份市售生鮮豬肉作為供試材料，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照控制樣品的質(zhì)量。 表7 表明：僅有一份超市銷售的豬肉樣品中檢測(cè)出磺胺二甲嘧啶，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.94 μg/kg。

3 結(jié) 語(yǔ)

表5 20種藥物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，LOD and LOQ of 20 drugs

表6 20種藥物的加標(biāo)回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 6 Spiked recovery and relative standard deviation（n=6）of 20 drugs

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度好、 準(zhǔn)確度高，同時(shí)能夠突破現(xiàn)行有效檢測(cè)方法分類檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)多種類獸藥殘留的高通量同時(shí)檢測(cè)。 作者應(yīng)用UPLC-MS/MS 法檢測(cè)豬肉中6 類共20種獸藥殘留，所有檢測(cè)目標(biāo)物分離良好，重現(xiàn)性好，并且采用Oasis PRiME HLB 小柱凈化樣品，使得前處理方法簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)效率提高。

續(xù)表6

表7 生鮮豬肉20種獸藥殘留檢測(cè)結(jié)果Table 7 Detection results of 20 drugs in meat

作者試驗(yàn)20種獸藥殘留的檢出限可達(dá)到0.5～5.0 μg/kg， 其中喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的檢出限分別低于國(guó)家現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21312-2007 和出入境檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1777.2-2007 中規(guī)定的1～3 μg/kg[25]和20 μg/kg[26]；磺胺類獸藥殘留的檢出限能達(dá)到現(xiàn)行有效檢測(cè)方法農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告中規(guī)定的0.5 μg/kg[27]。 低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率在62.1%～118.3%， 均在國(guó)家現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008 中規(guī)定的60%～120%內(nèi)[28]，RSD 為0.4%～16.7%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。 該方法在實(shí)際應(yīng)用中，檢測(cè)效果良好，可用于豬肉樣品中多種獸藥殘留的高通量快速檢測(cè)。