磷酸鹽存在時(shí)食品大分子的干燥加熱磷酸化及其多功能化研究進(jìn)展

殷春雁，趙宇婷，劉自單，李燦鵬，*

（1.紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南紅河661199；2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650091）

食品大分子的功能特性如凝膠性、起泡性、持水性、乳化性等在食品工業(yè)中發(fā)揮著非常重要的作用。一直以來(lái)，食品化學(xué)家們?yōu)楦纳剖称返墓δ芴匦?，通常?duì)食品蛋白質(zhì)或多糖等大分子進(jìn)行改性[1]。食品大分子的改性是一種研究其結(jié)構(gòu)與功能特性的關(guān)系（即構(gòu)-效關(guān)系）的有效方法，這些方法包括物理改性、化學(xué)改性和酶法改性等[2]。物理改性法包括干燥加熱、高壓處理和γ-射線照射處理等；酶法改性通常是蛋白酶的有限水解，改性的程度與酶的量、底物濃度、水解的因素等相關(guān)[3]；化學(xué)改性法包括：去酰胺、共價(jià)交聯(lián)、?；?、羰基化、磷酸化、糖基化、水解及氧化等，主要是對(duì)殘基上的氨基、羥基、巰基或羧基等基團(tuán)進(jìn)行修飾，而這些修飾的本質(zhì)是通過(guò)改變食品大分子的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、靜電荷、氫鍵、疏水作用力等，來(lái)改善其乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性、溶解性、凝膠特性、保水性等加工特性[4]。同時(shí)有些基團(tuán)的引入還可以賦予食品高分子本身沒(méi)有的一些生理功能特性，如免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)鈣的吸收等特性[5]。

在上述的改性方法中，有些方法的改性產(chǎn)物雖然不能用于食品加工配料，但是這些研究可以為食品高分子的深度開(kāi)發(fā)和利用提供有益的思路。從應(yīng)用的角度出發(fā)，如果一個(gè)改性方法具備簡(jiǎn)單、易行、安全和廉價(jià)等特點(diǎn)，那將有利于其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。干燥加熱技術(shù)是食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，其以安全、簡(jiǎn)單、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn)著稱。近年來(lái)，利用干燥加熱技術(shù)對(duì)食品蛋白或淀粉等食品大分子進(jìn)行修飾，以期獲得功能特性得以改善的產(chǎn)品是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

1 食品大分子的重要功能特性及磷酸化作用改性

1.1 食品大分子的重要功能特性

1.1.1 乳化性

一般認(rèn)為蛋白質(zhì)乳狀液體系的穩(wěn)定與界面張力成反向關(guān)系，而與蛋白質(zhì)的疏水性成正向關(guān)系[6]。糖基化反應(yīng)使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，疏水基團(tuán)在水-油界面發(fā)生變性從而溶解在油滴中，多糖部分親水性強(qiáng)，則溶解于水中，從而維持蛋白質(zhì)乳狀液體系的穩(wěn)定[7]。另外，硒酸化或磷酸化修飾也能很好地改善食品蛋白的乳化性和乳狀液體系的穩(wěn)定性[8]。

1.1.2 凝膠性

蛋白質(zhì)分子經(jīng)適度變性處理，分子發(fā)生聚集而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)凝膠[6]。蛋白質(zhì)分子聚集形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使食品具有良好的質(zhì)地。例如：肉類食品的質(zhì)地、保水、黏結(jié)和穩(wěn)定脂肪等特性都受到蛋白質(zhì)分子聚集形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響。蛋白質(zhì)分子聚集形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能對(duì)另一些食品如豆腐、酸乳等的品質(zhì)形成產(chǎn)生直接影響[6]。研究證明磷酸化改性能有效提高蛋清蛋白的凝膠性和凝膠穩(wěn)定性[8]。

1.1.3 起泡性

泡沫通常是指氣體在連續(xù)液相或半固相中分散形成的分散體系，典型的泡沫食品如冰淇淋、啤酒、奶油等[6]。在穩(wěn)定的泡沫體系中，由彈性的薄層連續(xù)相將各個(gè)氣泡分開(kāi)，氣泡的直徑從1 cm到幾厘米不等。蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力受到疏水性、肽鏈的柔軟性和溶解性等因素的影響。蛋白質(zhì)的流變學(xué)性質(zhì)決定泡沫穩(wěn)定性[6]。蛋清蛋白干燥加熱或干燥加熱磷酸化之后，起泡性明顯增加[8]。

1.2 食品大分子的磷酸化作用改性

無(wú)機(jī)磷酸和蛋白質(zhì)分子中特定的氮原子或氧原子發(fā)生酯化反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)被磷酸化。一些化學(xué)方法、酶法和糖基化法可以用于蛋白質(zhì)的磷酸化改性[2]。它們各有優(yōu)缺點(diǎn)：（1）化學(xué)磷酸化法：采用一些含有磷酸基的試劑，例如三聚磷酸鈉、磷酸和磷酰氯等作為磷酸化試劑。該法的優(yōu)點(diǎn)：磷酸化試劑一般價(jià)格低、效率高，功能特性（如乳化性、凝膠性和起泡性等）改善比較明顯，很容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)從而廣泛應(yīng)用于工業(yè)。但是，該方法具有反應(yīng)比較劇烈、副反應(yīng)產(chǎn)物較多、容易使蛋白質(zhì)變性并且化學(xué)試劑難以除去等缺點(diǎn)使其在食品工業(yè)中有一定的局限性[9-11]。（2）蛋白激酶：如酪蛋白激酶Ⅱ和依賴于環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）激活的蛋白激酶。該方法的優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件較為溫和、副反應(yīng)較少、反應(yīng)位點(diǎn)的高度專一性、反應(yīng)過(guò)程中能量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值沒(méi)有損失。但是，該方法機(jī)理非常復(fù)雜、能夠使蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶種類較少和能被磷酸化的氨基酸系列有限等缺點(diǎn)使該方法很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[12-16]。（3）采用含有磷酸基的還原糖如葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸等和蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而使食品蛋白磷酸化。美拉德反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，同時(shí)該方法副產(chǎn)物非常多，很容易發(fā)生褐變，這是很難克服的難題[17-20]。

2 食品大分子的干燥加熱磷酸化法改性

為避免以上磷酸化法的缺點(diǎn)，前人一直致力于開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單、有效且經(jīng)濟(jì)的食品蛋白磷酸化改性方法。Taillar等[21]在1994年研究了在干燥加熱的條件下，磷酸鹽能使蛋白質(zhì)及糖蛋白、氨基酸以及糖的羥基磷酸化，其反應(yīng)為：

R-OH+H3PO4→R-O-H2PO3+H2O（R代表蛋白質(zhì)）

研究結(jié)果表明如果適當(dāng)改變磷酸鹽和蛋白質(zhì)及多糖等反應(yīng)的條件，例如pH值、反應(yīng)溫度、磷酸鹽濃度和干燥加熱等，蛋白質(zhì)及多糖的功能特性有望得到改善?；谏鲜鲞@些結(jié)果，Li等[19-20]采用不同磷酸化試劑對(duì)干燥加熱磷酸化做了對(duì)比性研究，結(jié)果表明，焦磷酸作為磷酸化試劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件較為溫和、副反應(yīng)少、磷酸化試劑容易除去。同時(shí)，他們研究了蛋清分離蛋白和乳球蛋白：在糖基化的基礎(chǔ)上再進(jìn)行干燥加熱磷酸化，結(jié)果改善了食品蛋白的熱穩(wěn)定性、磷酸鈣可溶能力和凝膠性等功能特性。

2.1 干燥加熱磷酸化及其機(jī)理

為了比較不同食品蛋白質(zhì)磷酸化程度，研究報(bào)道了將蛋清蛋白（egg white proteins，EWP），乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）和酪蛋白（casein，CN）進(jìn)行磷酸化，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，EWP比WPI和CN容易被磷酸化，相對(duì)于正磷酸鹽來(lái)說(shuō)，焦磷酸鹽存在時(shí)各種蛋白質(zhì)更容易被磷酸化[22-23]。

表1 磷酸化對(duì)食品蛋白功能特性的改善Table 1 Improvement of functional properties and physiological functions（in vitro）of proteins by phosphorylation

在干燥加熱條件下用焦磷酸鹽對(duì)蛋清蛋白（EWP）進(jìn)行磷酸化處理，pH 3～7時(shí)，食品蛋白質(zhì)的磷酸化程度隨溶液pH值增加而減小，而隨加熱時(shí)間及加熱溫度的增加而增大。用焦磷酸鹽對(duì)EWP進(jìn)行磷酸化，EWP的最佳磷酸化條件為：pH4.0，加熱溫度為85℃，反應(yīng)時(shí)間為5 d。此條件下測(cè)定其磷含量達(dá)到0.97%，高于典型的磷蛋白—牛酪蛋白的磷含量（0.80%）。表明蛋白質(zhì)中磷的導(dǎo)入可能會(huì)影響食品的功能特性[8，23]。另外，在磷酸鹽存在和干燥加熱的條件下，還成功地把可溶性淀粉進(jìn)行了磷酸化[31]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化干燥加熱磷酸化反應(yīng)的機(jī)理：磷酸鹽存在時(shí)食品蛋白的干燥加熱磷酸化發(fā)生在羥基和磷酸的羥基之間，此時(shí)，磷酸緩沖液中的H2PO32-如果較多，則會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生。而根據(jù)磷酸的電離式，該離子在pH 2～3時(shí)最多，因此在該pH值的條件下會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)，反應(yīng)溫度和時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)磷酸化的進(jìn)行。

2.2 食品大分子磷酸化修飾以后的理化性質(zhì)的改變

對(duì)蛋清蛋白和乳清分離蛋白進(jìn)行未變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（nondenaturing-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）檢測(cè)，結(jié)果顯示，磷酸化修飾能使蛋白的移動(dòng)速度加快，表明磷酸化修飾增加了蛋白質(zhì)的負(fù)電荷，證明磷酸基與蛋白質(zhì)是通過(guò)共價(jià)鍵的方式結(jié)合[32]。同時(shí)用核磁共振磷譜（31P nuclear magnetic resonance，31P NMR）檢測(cè)了磷酸化蛋白中導(dǎo)入的磷酸基類型，試驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)分子中成功導(dǎo)入了正磷酸和焦磷酸[20]。高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果表明在干燥加熱以后食品蛋白部分聚合，但磷酸化修飾并未影響到蛋白質(zhì)分子的聚合，此外，磷酸化修飾能提高蛋白質(zhì)的被消化率[8]。這一結(jié)果暗示可能是磷酸化修飾使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加疏松，所以其消化率也有顯著提升。食品蛋白質(zhì)磷酸化修飾前后的疏水性研究結(jié)果[26]也表明，各種食品蛋白的表面疏水性隨著磷酸化修飾程度的增加而增大，這與磷酸化后蛋白質(zhì)的被消化性增大是一致的。

2.3 磷酸化對(duì)食品大分子功能特性的改善

食品蛋白、淀粉等食品大分子在食品加工中有廣泛應(yīng)用，食品大分子在被磷酸化后，乳化活性和乳化液穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性都能得到大大改善（表1）。例如，pH值=7.0時(shí)，1 mg/mL的磷酸化EWP在100℃的溫度下加熱10 min，蛋白質(zhì)并未發(fā)生沉淀。非常有意義的是，磷酸修飾使蛋白膠體變得透明，表明磷酸化修飾使蛋白膠體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更規(guī)則，使開(kāi)發(fā)透明的熱誘導(dǎo)蛋白膠體成為可能。

研究磷酸化蛋白質(zhì)對(duì)磷酸鈣溶解性的影響，結(jié)果顯示：未磷酸化的蛋白幾乎不具備磷酸鈣可溶能力，但是，磷酸化后蛋白質(zhì)被賦予了很好的磷酸鈣可溶能力[5]。這一結(jié)果表明磷酸化修飾的蛋白質(zhì)溶液具有溶解磷酸鈣的功能特性，使食品蛋白質(zhì)被開(kāi)發(fā)為促進(jìn)鈣和磷吸收的保健品成為可能。另外，通過(guò)X-衍射的結(jié)果表明：磷酸化淀粉-鈣、磷復(fù)合物中鈣和磷不是以磷酸鈣晶體的形態(tài)存在，而是以無(wú)定型的形態(tài)存在[5]，表明這種復(fù)合物中鈣的存在形式有利于吸收?？傊?，干燥加熱磷酸化蛋白的乳化性、熱穩(wěn)定性、凝膠形成性及磷酸鈣可溶性等功能都得到明顯改善，有望開(kāi)發(fā)為具有特定功能的食品。

2.4 磷酸化對(duì)食品蛋白結(jié)構(gòu)的影響

用差示掃描熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）和圓二色譜（circular，CD）測(cè)定磷酸化修飾對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[26]。DSC測(cè)定結(jié)果顯示，磷酸化修飾的食品蛋白變性溫度降低。暗示磷酸化修飾的蛋白可能處于一種“可熔化的部分變性”狀態(tài)。CD測(cè)定結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)受磷酸化的影響比較明顯，而食品蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)受磷酸化的影響并不明顯。Sitohy等[33]報(bào)道了β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在化學(xué)磷酸化條件下被破壞，但是干燥加熱磷酸化修飾的β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有發(fā)生改變。這些結(jié)果表明食品蛋白的空間結(jié)構(gòu)受干燥加熱磷酸化修飾的影響較小。

2.5 磷酸化位點(diǎn)的解析

為了闡明磷酸化蛋白中的磷酸基位點(diǎn)，用胰蛋白酶水解磷酸化卵白蛋白和溶菌酶，并用鐵離子親和柱富集磷酸化肽，最后用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）測(cè)定所富集磷酸化肽的分子量，見(jiàn)表2[20]。

表2 磷酸化卵白蛋白和溶菌酶中可能被磷酸化的肽的片段及位點(diǎn)Table 2 The possible phosphorylation site of tryptic peptides from PP-Lz and PP-OVA identified by MALDI-TOF-MS after IMAC

如表2所示，一些可能被磷酸化的肽已經(jīng)被成功地鑒定，同時(shí)證明除正磷酸之外，焦磷酸或三磷酸也有可能被引入蛋白質(zhì)中。該結(jié)果表明正磷酸化的蛋白有可能進(jìn)一步被磷酸化。該研究是首次對(duì)合成的磷酸化蛋白進(jìn)行鑒定。

3 展望

改善食品大分子的功能特性，進(jìn)一步擴(kuò)大食品大分子在食品工業(yè)中的應(yīng)用，一直是食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)。為了尋找一種安全、有效且經(jīng)濟(jì)的磷酸化方法，食品化學(xué)家們一直致力于干燥加熱磷酸化對(duì)食品大分子功能影響的研究。試驗(yàn)證明該方法有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）安全可靠。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，所使用的試劑對(duì)人體無(wú)毒害，這一點(diǎn)在食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域非常重要。（2）能較大程度提高食品大分子的乳化特性、熱穩(wěn)定性及凝膠特性，還能賦予食品大分子磷酸鈣可溶性等特殊功能。這些結(jié)果都說(shuō)明干燥加熱磷酸化法有望成為開(kāi)發(fā)功能食品的新方法。（3）食品大分子結(jié)構(gòu)幾乎不受影響。研究結(jié)果顯示干燥加熱磷酸化修飾幾乎不會(huì)造成食品蛋白質(zhì)分子中氨基酸的損失。今后，磷酸化修飾賦予食品大分子新的功能，如促進(jìn)鈣吸收、免疫調(diào)節(jié)等方面的研究將會(huì)成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。