鹽酸小檗堿對老年大鼠心肌細胞抗氧化及相關(guān)凋亡蛋白表達的影響

張慶峰 呂霄芳

(1棗莊市婦幼保健院，山東 棗莊 277100；2棗莊市中醫(yī)院)

細胞的衰老與線粒體過多的自由基及細胞凋亡密切相關(guān),因此探索能清除自由基抗凋亡、維持線粒體正常功能的天然藥物對于抗衰老尤為重要〔1〕。小檗堿是從植物黃連根莖中提取的有效藥用成分，近年研究表明具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等臨床藥理作用〔2〕，且對于抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有良好作用。有關(guān)小檗堿的心肌抗氧化應(yīng)激作用研究主要集中缺血再灌注損傷方面，但在小檗堿對老年大鼠心肌線粒體能量代謝及凋亡的影響報道較少〔3〕，本文研究小檗堿在老年大鼠心肌細胞抗氧化及凋亡的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 SD雄性大鼠購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，共計40只，小檗堿片劑購自東北制藥總廠。其中10只3月齡大鼠作為青年組，平均體重(297±31.5)g,30只20～22月齡大鼠為老齡組，平均體重(698±67.9)g。按照完全隨機分組，其中10只給予低劑量100 mg鹽酸小檗堿灌胃(100 mg 組)，10只給予200 mg小檗堿灌胃(200 mg組)，10只為老齡對照(老年)組，老年組與青年組每天給予等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠室溫下分籠飼養(yǎng)，正常自由飲水進食，連續(xù)觀察4 w后處死。

1.2方法

1.2.1電鏡觀察 以丙二醛(MDA)固定約芝麻大小的心尖位置心肌組織，以O(shè)lympus電鏡觀察各組心肌特征差異。

1.2.2心肌線粒體的提取與測定 首先制備介質(zhì)Ⅰ〔0.25 mol /L 蔗糖溶液，3.0 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH7.4〕與介質(zhì) Ⅱ(0.25 mol/L蔗糖溶液，2.0 mmol/L HEPES，0.5 mmol/L EDTA，pH7.4)，將大鼠心臟剪成小塊，用介質(zhì)Ⅰ浸潤去除血污，濾干勻漿后取上清液離心，用介質(zhì)Ⅱ浸潤沉淀物，制備成線粒體懸液，考馬斯亮藍G250法測定心肌線粒體蛋白含量。線粒體呼吸鏈酶復合體(Co)Ⅳ活力測定與超氧化物歧化酶(Mn-SOD) 活性的測定分別采用王學美等〔4〕方法與黃嘌呤氧化酶法〔5〕。采用硫代巴比妥酸(TBA) 法檢測心肌線粒體 MDA 含量。

1.2.3Western印跡法 采用Western印跡法檢測心肌細胞中Bcl-2、CoⅣ及Bax蛋白的表達。

1.2.4TUNEL染色及分析 用TUNEL-POD法將裂解后心肌組織切片染色，在光鏡下正常心肌細胞核呈藍紫色，凋亡心肌細胞核呈棕黃色顆粒，在400 倍高倍鏡視野下每張切片隨機選取20個非重疊區(qū)域，鏡下分別計數(shù)凋亡細胞核數(shù)和觀察的總心肌細胞數(shù)，通過計算平均值得出心肌細胞凋亡率〔6〕。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1電鏡下鹽酸小檗堿對老年SD大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 與青年組比較，老年組心肌肌絲排列雜，心肌可見潤盤模糊，肌原纖維有疏散、斷裂、溶解現(xiàn)象，心肌線粒體膨脹腫大，且嵴減少；還可見紋狀嵴線粒體和巨大線粒體。小檗堿治療后心肌肌絲恢復整齊，線粒體結(jié)構(gòu)正常且潤盤連續(xù)，與青年組有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 電鏡下各組心肌超微結(jié)構(gòu)(×1 700)

2.2鹽酸小檗堿對SD大鼠心肌線粒體內(nèi)Mn-SOD、MDA及CoⅣ的影響 與老年組比較，青年組心肌線粒體內(nèi) Mn-SOD 及CoⅣ活性顯著較高(P<0.05,P<0.01)，MDA含量顯著減少(P<0.05)；100 mg組、200 mg組Mn-SOD、COⅣ活性顯著增加(P<0.05,P<0.01)，且MDA含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 鹽酸小檗堿對SD大鼠心肌線粒體內(nèi) Mn-SOD、MDA及CoⅣ含量的影響

2.3鹽酸小檗堿對老年SD大鼠心肌CoⅣ 蛋白水平影響 與老年組相比，青年組CoⅣ蛋白表達水平顯著降低。不同濃度的用藥組 與老年組比較，CoⅣ蛋白表達隨用藥濃度增加而逐漸降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表2、圖2。

表2 各組CoⅣ、Bax、BCL-2相對蛋白表達水平比較

圖2 Western印跡法檢測CoⅣ蛋白表達

2.4鹽酸小檗堿對 SD大鼠心肌細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響。與老年組比較，青年組Bcl-2表達顯著升高而Bax顯著降低(P<0.05)；小檗堿用藥組Bcl-2顯著升高，Bax顯著降低(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。

圖3 Western印跡檢測Bax蛋白表達

圖4 Western印跡法檢測Bcl-2蛋白表達

2.5鹽酸小檗堿對SD大鼠心肌細胞凋亡率的影響 青年組心肌細胞核在光鏡下呈淡藍色，提示心肌細胞正常狀態(tài)；老年組心肌細胞核在光鏡下呈現(xiàn)深淺不同的深褐色，提示有大量凋亡的心肌細胞。與老年組比較，不同濃度的用藥組凋亡的心肌細胞明顯減少，電鏡下可見極少量分散分布的凋亡細胞。見圖5。青年組 、老年組、 100 mg組、 200 mg組心肌細胞凋亡率分別為(0.78±0.34)%、 (11.2±1.55)%、(6.13±0.92)%、(3.89±1.98)%。

圖5 各組心肌細胞TUNEL染色(×200)

3 討 論

本研究通過電鏡下觀察心臟超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿干預治療老年大鼠后，其線粒體形態(tài)規(guī)整且密度較好，較少發(fā)現(xiàn)空泡及水腫，肌絲排列有序，潤盤完整〔7〕，提示小檗堿對細胞內(nèi)線粒體功能有保護作用。線粒體自由基過氧化是造成細胞衰老的主要誘因。檢測線粒體MDA作為脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物，可以一定程度反映氧化損傷程度〔8〕。Mn-SOD能在線粒體中發(fā)揮清除超氧化物自由基的作用〔9〕。隨著機體的衰老，細胞內(nèi)Mn-SOD含量減少造成MDA含量增加，最終抗氧化物質(zhì)進一步減少〔10〕。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年SD大鼠其MDA含量顯著高于青年大鼠，而Mn-SOD含量較低。使用鹽酸小檗堿后能顯著降低老年大鼠中MDA的含量，增加了Mn-SOD的活性。考慮可能的機制鹽酸小檗堿中的抗氧化成分直接中和氧化自由基，使Mn-SOD活力升高〔11〕。另一方面可能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程引起下游MDA含量降低。而CoⅣ是線粒體呼吸鏈重要組成成分，其是整個呼吸鏈的關(guān)鍵酶。但CoⅣ性質(zhì)極不穩(wěn)定易受自由基氧化損傷，丟失電子的CoⅣ引起呼吸鏈功能喪失，造成三磷酸腺苷(ATP)合成的減少加重氧化應(yīng)激損傷程度〔12,13〕。本研究結(jié)果表明心肌線粒體 CoⅣ活性在老年大鼠中活性較低，酶復合物的活性在使用鹽酸小檗堿后有所提高。從分子蛋白角度發(fā)現(xiàn)，老年大鼠的CoⅣ蛋白表達增加，鹽酸小檗堿干預后CoⅣ蛋白表達降低。這種現(xiàn)象可能由于衰老的機體為維持正常代謝功能，產(chǎn)生更多的Co蛋白進行補充，造成老年大鼠體內(nèi)CoⅣ活性降低而蛋白增加的現(xiàn)象〔14～16〕。而鹽酸小檗堿通過提高CoⅣ的活性負反饋細胞內(nèi)CoⅣ蛋白表達水平。本實驗發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以抑制老年大鼠氧自由基損傷，對于心肌細胞有抗氧化保護作用〔17,18〕。為進一步研究小檗堿是否有阻止心肌細胞在衰老損傷過程中的凋亡作用，本實驗通過觀察小檗堿對于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax表達作用及TUNEL染色來確定。在研究中發(fā)現(xiàn)灌注小檗堿的老年大鼠Bcl-2升高明顯，Bax降低，Bcl-2/Bax比值升高。說明鹽酸小檗堿不僅能增加Bcl-2蛋白表達，且減少Bax蛋白表達，從而保護心肌細胞免受凋亡。同時TUNEL染色檢測進一步證實小檗堿能降低衰老心肌細胞的凋亡指數(shù)。通過以往研究鹽酸小檗堿抑制凋亡的機制主要通過抑制α1受體造成大量鈣離子內(nèi)流，減少細胞鈣超載從而阻斷凋亡啟動〔19〕。也可能通過降低超氧陰離子來減少自由基含量，引起細胞凋亡率的下降。而小檗堿在老年大鼠中抗凋亡的具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，鹽酸小檗堿具有抗氧化與抑制凋亡的作用，從而達到抑制心肌衰老的作用，機制可能與清除氧自由基抑制凋亡形成進一步提高細胞抗損傷能力有關(guān)。