Streptomyces yanglingensis KM-1-2遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及 km790的過(guò)表達(dá)

武立清，孫 玲，黃麗麗，顏 霞

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100; 3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前所發(fā)現(xiàn)的抗生素約2/3直接或間接來(lái)源于微生物，其中鏈霉菌是主要的生物活性物質(zhì)生產(chǎn)者[1-2]。鏈霉菌是一類好氧、高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌，能夠產(chǎn)生種類繁多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及畜牧業(yè)中體現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。

楊凌鏈霉菌KM-1-2是從銀杏種子中分離到的鏈霉菌(Streptomyces)新種[3]。全基因組測(cè)序結(jié)果表明，KM-1-2基因組大小約為5.78 Mb，GC含量達(dá)72.8%，預(yù)測(cè)得到5 299個(gè)編碼基因，占基因組全長(zhǎng)的88.67%。根據(jù)antiSMASH在線分析結(jié)果，KM-1-2基因組共有21個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，包括非核糖體多肽合成酶(Non-ribosomal Peptide Synthetase, NRPS)、聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)、萜烯類(Terpene)、鐵載體(Siderophore)及四氫嘧啶(Ectoine)等多種類型。其中NRPS型基因簇Cluster 4上存在1個(gè)SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子km790，SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包括1個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD)和1個(gè)毗鄰的細(xì)菌轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(bacterial transcriptional activation domain, BTAD)，通常被認(rèn)為在抗生素合成途徑中發(fā)揮正調(diào)控的作用[4-7]。在鏈霉菌抗生素合成的過(guò)程中，SARPs通過(guò)招募RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)到目的基因的啟動(dòng)子上形成1個(gè)DNA-SARP-RNAP激活轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[8]，從而促進(jìn)目標(biāo)抗生素的合成。為了進(jìn)一步研究菌株KM-1-2的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，必須先建立簡(jiǎn)單高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

鏈霉菌中外源質(zhì)粒或基因?qū)氲姆椒ㄖ饕邪≒EG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法、接合轉(zhuǎn)移法和電轉(zhuǎn)化法[9-11]。原生質(zhì)體法是一種常規(guī)的基因轉(zhuǎn)移方法，但由于很多鏈霉菌都具有限制修飾系統(tǒng)[12]，所以外源遺傳物質(zhì)難以轉(zhuǎn)化進(jìn)入，而接合轉(zhuǎn)移操作簡(jiǎn)便，能夠避開(kāi)胞外核酸酶，在一定程度上可以克服鏈霉菌對(duì)外源遺傳物質(zhì)的限制[13]。Mazodier等[14]于1989年首次建立大腸桿菌-鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移法；而后隨著大量穿梭質(zhì)粒成功的構(gòu)建[15]，接合轉(zhuǎn)移法作為一種高效的基因轉(zhuǎn)移法被廣泛用于鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。如：Azalomycin F產(chǎn)生菌—鏈霉菌21172613(Streptomycessp. 21172613)[16]、Toyocamycin產(chǎn)生菌—淀粉產(chǎn)色鏈霉菌1628(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[17]、Xinaomycins產(chǎn)生菌—諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)[18]以及谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌(Streptomycesmobaraensis)[19]接合轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建。

本研究首次通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將外源質(zhì)粒導(dǎo)入楊凌鏈霉菌KM-1-2中，建立并優(yōu)化該菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)過(guò)表達(dá)SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子km790，并檢測(cè)過(guò)表達(dá)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)及對(duì)病原真菌的拮抗性，為后續(xù)研究KM-1-2的次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成及其調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒菌株 鏈霉菌(Streptomycesyanglingensis)KM-1-2、大腸桿菌(Escherichiacoli)S17-1、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、蘋果腐爛病菌(Valsamali)03-8、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)及葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)均來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)果樹(shù)病害研究室。

質(zhì)粒：pSET152為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭整合型質(zhì)粒，具有安普霉素抗性基因acc(3)Ⅳ、接合轉(zhuǎn)移起點(diǎn)OriT、pUC18復(fù)制子、噬菌體φC31整合酶(int)基因和attP整合位點(diǎn)[15]；pSET152-ermEp*為帶有紅霉素抗性基因啟動(dòng)子的過(guò)表達(dá)型質(zhì)粒，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院賈良輝老師饋贈(zèng)；pKC1139為溫敏穿梭型質(zhì)粒，具有安普霉素抗性基因acc(3)Ⅳ，在溫度高于39 ℃時(shí)不能自主復(fù)制，常用于鏈霉菌的基因敲除[15]。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基 鏈霉菌KM-1-2產(chǎn)孢培養(yǎng)基為黃豆粉培養(yǎng)基；孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT；接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基分別采用高氏Ⅰ號(hào)、MS、2CMY及黃豆粉培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)；發(fā)酵培養(yǎng)基為SPY，具體配方參見(jiàn)鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[20]；大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B；病原真菌采用PDA培養(yǎng)基。

抗生素：安普霉素(Apramycin)、卡那霉素(Kanamycin)、紅霉素(Erythromycin)、潮霉素(Hygromycin)、萘啶酮酸(Nalidixicacid)均購(gòu)自上海生工。

1.2 方 法

1.2.1 質(zhì)粒及鏈霉菌基因組提取 大腸桿菌質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化參照分子生物學(xué)指南[21]，鏈霉菌基因組DNA和質(zhì)粒的提取參照鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[20]。

1.2.2 抗生素耐受性測(cè)定 分別配制含安普霉素、卡那霉素、紅霉素、潮霉素以及萘啶酮酸不同質(zhì)量濃度梯度(0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L)的黃豆粉培養(yǎng)基平板，劃線接種鏈霉菌KM-1-2，28 ℃培養(yǎng)6 d后觀察菌株的生長(zhǎng) 情況。

1.2.3 接合轉(zhuǎn)移 將整合型質(zhì)粒pSET152通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，得到供體菌大腸桿菌S17-1/pSET152。挑取單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基(含Apr 50 mg/L)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h后按體積比1∶100轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基(含Apr 50 mg/L)中。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)離心收集菌體，用等體積不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基洗滌菌體3次，最后將菌體懸浮于0.5 mL的LB培養(yǎng)基中。同時(shí)，刮取生長(zhǎng)7 d的KM-1-2孢子，放入10 mL蒸餾水中渦旋振蕩并過(guò)濾，2 739 g離心10 min收集孢子，并懸浮于0.5 mL的2×YT培養(yǎng)基中。45～55 ℃熱激10 min后于28 ℃、180 r/min預(yù)萌發(fā)2～3 h。將備用的大腸桿菌S17-1和預(yù)萌發(fā)好的KM-1-2孢子懸液按體積比為1∶1的比例混合，涂布于接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 16～20 h后覆蓋萘啶酮酸(質(zhì)量濃度25 mg/L)和安普霉素(質(zhì)量濃度3 mg/L)，然后于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至長(zhǎng)出接合子。本試驗(yàn)中供體菌大腸桿菌S17-1的數(shù)量密度保持為108CFU/mL，受體菌KM-1-2孢子數(shù)密度為107～109CFU/mL，最后以肉眼可分辨的轉(zhuǎn)化子為準(zhǔn)。接合效率=接合子數(shù)/孢子量，取3次重復(fù)的平均值。

溫敏型穿梭質(zhì)粒pKC1139的接合轉(zhuǎn)移方法同上。

1.2.4 接合子的PCR驗(yàn)證 將接合子轉(zhuǎn)接在含有安普霉素(Apr 3 mg/L)的黃豆粉培養(yǎng)基上，挑取單克隆接種于TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

pSET152型接合子的驗(yàn)證需提取鏈霉菌基因組DNA作為模板。根據(jù)安普霉素抗性基因設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，以鏈霉菌KM-1-2基因組DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pSET152為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增Apr抗性基因，片段大小為750 bp。PCR反應(yīng)體系： 5 μL的2×TaqMasterMix，10 μmol/L的正反引物各1 μL，1 μL的DNA模板，1 μL的DMSO，ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物由上海生工合成，序列如下：AMF，5′-GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC-3′；AMR，5′-ATGAGCTCAGCCAATC- GACTGG-3′。

pKC1139型接合子的驗(yàn)證需提取鏈霉菌質(zhì)粒作為模板。根據(jù)pKC1139載體上的序列設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物，以鏈霉菌KM-1-2的質(zhì)粒為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pKC1139為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增片段大小為898 bp。PCR反應(yīng)體系：5 μL的2×TaqMasterMix，10 μmol/L的正反引物各1 μL，1 μL的DNA模板，1 μL的DMSO，ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。引物由上海生工合成，序列如下：pKCF，5′-AAGGCGATTAAGTTGGGTA-3′；pKCR，5′-GTGGCGATAAGTCGTGTCT-3′。

1.2.5 過(guò)表達(dá)菌株Skm790的構(gòu)建 根據(jù)鏈霉菌KM-1-2中km790基因序列設(shè)計(jì)引物，并在引物5′端引入pSET152-ermEp*載體雙酶切末端同源序列及酶切位點(diǎn)，引物序列如下：km790F，5′-TCGTGCCGGTTGGTAGGATCCCCACAGGAGGACGTGACATGGAGTTCCGGATACT-CGGCCCG-3′；km790R，5′-AGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGATCAGCCGGCCGCCG-CCAC-3′，由上海生工合成。模板為鏈霉菌KM-1-2基因組DNA，PCR反應(yīng)體系：25 μL的2×Phanta Max Buffer，1 μL的10 mmol/L dNTP Mix，10 μmol/L的正反引物各2 μL，1 μL基因組DNA模板，1 μL 的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后與經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后的pSET152-ermEp*載體回收產(chǎn)物通過(guò)一步克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)(Vazyme)進(jìn)行連接，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。挑取單克隆提取質(zhì)粒，PCR檢測(cè)后測(cè)序驗(yàn)證，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pSkm790。將重組質(zhì)粒pSkm790轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1中，與野生型鏈霉菌KM-1-2進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移獲得接合子。提取基因組DNA，用Apr抗性引物AMF/AMR進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以野生型鏈霉菌KM-1-2為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pSkm790為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 過(guò)表達(dá)菌株Skm790表型及活性檢測(cè) 挑取野生型菌株KM-1-2與過(guò)表達(dá)菌株Skm790的單菌落分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL菌液，重復(fù)3次。烘干后測(cè)量菌絲體干質(zhì)量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲體干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。此外，將鏈霉菌KM-1-2和Skm790分別接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察二者的產(chǎn)孢情況。

采用皿內(nèi)對(duì)峙的方法，檢測(cè)野生型菌株KM-1-2與過(guò)表達(dá)菌株Skm790對(duì)病原真菌的拮抗性。將病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng) 3 d，鏈霉菌KM-1-2和Skm790分別接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用打孔器分別打取菌餅。然后將病原真菌的菌餅放置在PDA平板中央，距病原真菌菌餅2.5 cm處對(duì)稱接種野生型菌株KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790，25 ℃培養(yǎng)并觀察拮抗效果。

1.2.7 菌株發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分析 將生長(zhǎng)7 d的野生型菌株KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790分別接種于TSB種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。按體積比為1∶10的比例將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于SPY發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液用乙酸乙酯按體積比為1∶1的比例萃取3次，收集上層有機(jī)相旋蒸濃縮，濃縮后的產(chǎn)物用1 mL甲醇溶解后用于后續(xù)HPLC分析。

HPLC分析條件：利用C18反向?qū)游鲋?，采取梯度洗脫的方法，流?dòng)相為水(A)和甲醇(B)。整個(gè)洗脫過(guò)程如下：0～5 min，10% B；5～35 min，10%～100% B；35～45 min，100% B；45～50 min，100%～10% B；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 KM-1-2遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化

2.1.1 KM-1-2的抗生素耐受性 鏈霉菌KM-1-2的抗生素耐受性檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其對(duì)安普霉素和卡那霉素比較敏感，在Apr 1 mg/L、Kan 5 mg/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極慢，在Apr 2 mg/L、Kan 10 mg/L時(shí)不能生長(zhǎng)，對(duì)紅霉素、潮霉素和萘啶酮酸不敏感，在質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)仍可生長(zhǎng)。因此，接合轉(zhuǎn)移中可用安普霉素或卡那霉素作為抗性篩選標(biāo)記，用于篩選接合子，用25 mg/L的萘啶酮酸抑制供體菌大腸桿菌的 生長(zhǎng)。

表1 KM-1-2對(duì)不同抗生素的敏感性Table 1 Sensitivity of KM-1-2 to antibiotics

2.1.2 接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的選擇 選取高氏Ⅰ號(hào)、MS、2CMY及黃豆粉培養(yǎng)基作為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，結(jié)果如表2所示，高氏Ⅰ號(hào)和MS培養(yǎng)基上均未長(zhǎng)出接合子。黃豆粉培養(yǎng)基上接合子長(zhǎng)勢(shì)良好，但大腸桿菌生長(zhǎng)速率較快，二者混合生長(zhǎng)，難以挑出單菌落。而2CMY培養(yǎng)基上接合子數(shù)量多且大腸桿菌生長(zhǎng)速率較慢，因此選擇2CMY作為接合轉(zhuǎn)移最適培養(yǎng)基。

表2 KM-1-2接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的選擇Table 2 Selection of KM-1-2 conjugation transfer medium

2.1.3 熱激溫度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 選取45、50、55 ℃ 3個(gè)熱激溫度，分別處理10 min，然后于28 ℃、180 r/min預(yù)萌發(fā)2.5 h。結(jié)果如表3所示，在50 ℃，熱激10 min的條件下，接合轉(zhuǎn)移效率最高，達(dá)1.052×10-5。溫度為45 ℃時(shí)，接合效率為5.16×10-6，而當(dāng)熱激溫度為55 ℃時(shí)，沒(méi)有接合子出現(xiàn)。因此，50 ℃熱激10 min后，于28 ℃、180 r/min預(yù)萌發(fā)2.5 h為孢子預(yù)萌發(fā)的最適條件。

2.1.4 接合轉(zhuǎn)移時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 選取17～18、18～19、19～20 h 3個(gè)時(shí)間段覆蓋抗生素，其中萘啶酮酸的質(zhì)量濃度為25 mg/L，安普霉素的質(zhì)量濃度為3 mg/L。結(jié)果如表4所示，在17～18 h覆蓋抗生素時(shí)，接合子較少。在18～19 h覆蓋抗生素，接合轉(zhuǎn)移效率最高，達(dá)到 1.052×10-5。而在19 h后再覆蓋抗生素則得不到接合子。因此，18～19 h，Nal 25 mg/L，Apr 3 mg/L為鏈霉菌KM-1-2抗生素覆蓋的最佳 條件。

表3 不同熱激溫度下KM-1-2接合轉(zhuǎn)移效率Table 3 Conjugation frequency of KM-1-2 at differentheat shock temperatures

表4 不同接合轉(zhuǎn)移時(shí)間下KM-1-2接合轉(zhuǎn)移效率Table 4 Conjugation frequency of KM-1-2at differentconjugation transfer times

2.1.5 接合子的PCR鑒定及穩(wěn)定性檢測(cè) pSET152是基因整合型質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)入鏈霉菌KM-1-2后，整合在該菌株的基因組上。隨機(jī)挑取接合子，參照CTAB法提取基因組DNA，利用安普霉素抗性基因引物AMF/AMR進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照pSET152和接合轉(zhuǎn)化子均可以擴(kuò)增出750 bp的Apr基因片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未擴(kuò)增出目的片段，由此證明質(zhì)粒pSET152成功整合在鏈霉菌KM-1-2的基因 組上。

pKC1139質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鏈霉菌KM-1-2后，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，利用質(zhì)粒上的序列引物pKCF/pKCR進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照pKC1139和接合轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出898 bp的目的片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未能擴(kuò)增出該片段，由此證明質(zhì)粒pKC1139成功轉(zhuǎn)入鏈霉菌KM-1-2中。

為了檢測(cè)質(zhì)粒在接合子中的遺傳穩(wěn)定性，將驗(yàn)證正確后的接合子在含有安普霉素和不含安普霉素的兩類平板上進(jìn)行抗性交替?zhèn)鞔?，傳?0次后接種于TSB培養(yǎng)基中(Apr 3mg/L，Nal 25 mg/L)培養(yǎng)，結(jié)果顯示接合子均可以正常生長(zhǎng)。提取基因組DNA或質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后，與之前的驗(yàn)證結(jié)果一致。表明質(zhì)粒pSET152/pKC1139均可以在KM-1-2中穩(wěn)定遺傳。

2.2 基因 km790的過(guò)表達(dá)

2.2.1 基因km790的生物信息學(xué) 通過(guò)antiSMASH分析鏈霉菌KM-1-2的全基因組，序列分析表明Cluster 4預(yù)測(cè)為NRPS型基因簇，該基因簇上存在1個(gè)SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子km790?；騥m790編碼1個(gè)含835個(gè)氨基酸的SARP家族蛋白，結(jié)果如圖1所示。該蛋白存在1個(gè)結(jié)合DNA的特征性結(jié)構(gòu)—螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Helix-turn-helix, HTH)和一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Bacterial Transcriptional Activation domain, BTA)，二者共同作用促進(jìn)基因簇的表達(dá)。

圖1 km790編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Functional domain prediction of km790 encoded protein

2.2.2 過(guò)表達(dá)菌株Skm790的構(gòu)建 通過(guò)接合轉(zhuǎn)移篩選過(guò)表達(dá)菌株Skm790，提取基因組DNA，利用Apr抗性基因引物AMF/AMR進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖2所示，陽(yáng)性對(duì)照pSkm790和過(guò)表達(dá)接合子Skm790均能擴(kuò)增出750 bp的目的片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未能擴(kuò)增出該片段，表明菌株Skm790過(guò)表達(dá)成功。

W. 野生型鏈霉菌KM-1-2；M. DNA Maker；P. 質(zhì)粒pSkm790；S. Skm790接合子

2.2.3 過(guò)表達(dá)菌株Skm790的表型及活性分析 野生型菌株KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。0～24 h處于菌體生長(zhǎng)的遲緩期，24 h后菌體生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，于96 h時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最大值，而當(dāng)培養(yǎng)至120 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)變緩，甚至有衰亡的趨勢(shì)。從兩株菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，與野生型菌株KM-1-2相比，過(guò)表達(dá)菌株Skm790生長(zhǎng)速率加快，菌體量 增加。

將野生型鏈霉菌KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790同時(shí)劃線接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株的生長(zhǎng)及形態(tài)分化，結(jié)果如圖4所示。在 28 ℃培養(yǎng)4 d時(shí)，野生型鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉平板及光學(xué)顯微鏡下可觀察到白色的氣生菌絲，而過(guò)表達(dá)菌株Skm790在產(chǎn)生氣生菌絲的同時(shí)可觀察到孢子鏈和孢子的產(chǎn)生。表明km790的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)孢子分化，使菌株的產(chǎn)孢時(shí)間提前。

鏈霉菌KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790對(duì)病原真菌的拮抗效果如圖5所示。結(jié)果表明，Skm790對(duì)病原真菌蘋果腐爛病菌、黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌以及葡萄灰霉病菌的抑菌圈均大于KM-1-2，抑制效果明顯強(qiáng)于野生型 KM-1-2。

圖3 鏈霉菌KM-1-2和Skm790的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of KM-1-2 and Skm790

2.2.4 次級(jí)代謝產(chǎn)物分析 檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，野生型鏈霉菌KM-1-2和過(guò)表達(dá)菌株Skm790的HPLC分析結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，在出峰時(shí)間為27.15和31.18 min左右時(shí)，Skm790對(duì)應(yīng)的吸收峰顯著增強(qiáng)，命名為X和Y。二者的紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示，X對(duì)應(yīng)的物質(zhì)在(225±1) nm和(277±1) nm處有典型吸收峰，而Y對(duì)應(yīng)的物質(zhì)在(218±1) nm和(278±1) nm處存在典型吸收峰。HPLC結(jié)果表明，基因km790對(duì)X和Y對(duì)應(yīng)物質(zhì)的合成起正調(diào)控作用，而本研究表明過(guò)表達(dá)菌株Skm790對(duì)病原真菌的拮抗性顯著大于野生型鏈霉菌KM-1-2，推測(cè)X或Y對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能與菌株的拮抗性相關(guān)。

鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)(A)及在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察(C)；過(guò)表達(dá)菌株Skm790在黃豆粉平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)(B)及在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察(D)

病原真菌從左向右依次為蘋果腐爛病菌、黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌、葡萄灰霉病菌；左側(cè)菌餅為野生型鏈霉菌KM-1-2，右側(cè)菌餅為過(guò)表達(dá)菌株Skm790

藍(lán)色曲線代表野生型鏈霉菌KM-1-2，黑色曲線代表過(guò)表達(dá)菌株Skm790

圖7 X(A)和Y(B)的紫外光譜Fig.7 UV spectrum of X(A) and Y(B)

3 討 論

本研究以楊凌鏈霉菌KM-1-2為出發(fā)菌株，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系。由于鏈霉菌是一個(gè)高度分化的菌屬，不同菌種之間差異很大，適用于一種鏈霉菌的轉(zhuǎn)化方法不一定適用于其他鏈霉菌[22-23]，而且由于遺傳背景的不同，即使同一種鏈霉菌的不同菌株，轉(zhuǎn)化效率也存在很大差別[24]。因此，本試驗(yàn)在鏈霉菌KM-1-2抗生素耐受性檢測(cè)、熱激溫度、接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基以及接合轉(zhuǎn)移時(shí)間等選擇的基礎(chǔ)上，探索該菌株的最佳轉(zhuǎn)化條件。

鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速且產(chǎn)孢量豐富，所以以黃豆粉培養(yǎng)基作為該菌最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基。在接合轉(zhuǎn)移時(shí)，大腸桿菌在黃豆粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，得到的轉(zhuǎn)化子易被污染，而在2CMY培養(yǎng)基上接合子數(shù)量多且大腸桿菌生長(zhǎng)速度緩慢，因此選擇2CMY作為最適接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。研究表明，適當(dāng)?shù)臒峒ぬ幚砜山档图?xì)胞內(nèi)限制酶的活性[25-26]，提高接合轉(zhuǎn)移效率，隨著熱激溫度的升高，接合轉(zhuǎn)移效率也隨之升高，但溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，孢子會(huì)喪失活性，因此確定最適熱激溫度為50 ℃。此外，抗生素覆蓋時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率也有顯著影響，時(shí)間少于17 h，接合轉(zhuǎn)移不完全，覆蓋抗生素時(shí)極易刮斷基內(nèi)菌絲，而時(shí)間長(zhǎng)于19 h，大腸桿菌大量生長(zhǎng)覆蓋培養(yǎng)基，難以挑出轉(zhuǎn)化子。綜合以上因素，適合楊凌鏈霉菌KM-1-2的遺傳轉(zhuǎn)化體系為：以2CMY為最適接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，孢子于50 ℃熱激10 min，抗生素覆蓋時(shí)間介于18～19 h，其中萘啶酮酸質(zhì)量濃度為25 mg/L，安普霉素為3 mg/L，此時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高，達(dá)1.052×10-5。

SARPs編碼基因是不同鏈霉菌中一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控基因，在trioxacarcin、indigoidine、pristinamycin、tacrolimus和chromomycins等的合成中，SARPs作為激活子促進(jìn)這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成[27-31]。本試驗(yàn)利用該轉(zhuǎn)化體系，成功將KM-1-2基因組中SARP家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子km790過(guò)表達(dá)，獲得的過(guò)表達(dá)菌株Skm790生長(zhǎng)速率加快，孢子產(chǎn)生時(shí)間提前，通過(guò)對(duì)部分病原真菌的拮抗性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其抗病性增強(qiáng)。代謝圖譜檢測(cè)分析結(jié)果表明，與野生型鏈霉菌KM-1-2相比，過(guò)表達(dá)菌株Skm790在保留時(shí)間為27.15和31.18 min左右時(shí)對(duì)應(yīng)的吸收峰顯著增強(qiáng)。推測(cè)該吸收峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能與菌株的拮抗性有關(guān)，但其確切的功能還需對(duì)菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，并對(duì)該物質(zhì)分離純化進(jìn)行鑒定，從而進(jìn)一步研究其抗病機(jī)制。

楊凌鏈霉菌KM-1-2遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及優(yōu)化是對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇進(jìn)行研究的必要前提，為進(jìn)一步對(duì)菌株資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。