芍藥舒筋片通過miRNA-140對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用*

徐海濤，高寧陽，顧新豐，張 琥，杜 炯，談繹文，王學(xué)宗，鄭昱新

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科(上海 201203)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性病變，多發(fā)生于中老年人群。在中醫(yī)理論中，OA被歸納于“骨痹”“骨痿”范疇，其發(fā)病機(jī)制為氣血不足，肝腎虧虛。人到中年，人體肝腎功能下降，供血不足，容易導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)，濕寒侵入機(jī)體后容易造成筋脈痹阻不通[1-2]。還可由激素紊亂、肥胖、關(guān)節(jié)過度勞損和外力損傷等因素引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退化和骨質(zhì)增生，嚴(yán)重影響患者的正常運(yùn)動(dòng)功能及其生活質(zhì)量[3-4]。因此，如何延緩及修復(fù)OA患者的關(guān)節(jié)軟骨退化和骨質(zhì)增生是目前骨關(guān)節(jié)病臨床上的一大熱點(diǎn)問題。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一個(gè)可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物進(jìn)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。微小核糖核酸(Micro ribonucleic acid，miRNA)能夠識(shí)別目標(biāo)miRNA的3’非編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行堿基配對(duì)，實(shí)現(xiàn)基因在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的負(fù)調(diào)控，從而能夠參與大多數(shù)真核生物的細(xì)胞凋亡、增殖等功能[6-7]。miRNA-140作為miRNA家族中的一員，其在斑馬魚等動(dòng)物中具有高度軟骨特異性[8]。芍藥舒筋片具有補(bǔ)益肝腎、散寒除濕、活血化瘀的功效，可用于治療OA早中期肝腎虧損，血瘀經(jīng)阻等癥狀的患者[9]。本研究通過構(gòu)建OA大鼠模型，研究芍藥舒筋片通過miRNA-140對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用，從而探討芍藥舒筋片對(duì)OA大鼠軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：取SD大鼠45只，體質(zhì)量(192.16±10.21)g。購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。復(fù)合飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20 ℃～25 ℃，濕度為60%。將45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(15%正常大鼠血清+F12培養(yǎng)基)、OA對(duì)照組(15%正常大鼠血清+F12培養(yǎng)基+IL-1β)、OA治療組(15%芍藥舒筋片含藥血清+F12培養(yǎng)基+IL-1β)，每組各15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：芍藥舒筋片(真空干燥粉)，由上海中醫(yī)大源創(chuàng)科技有限公司提供，批號(hào)：20110616。主要成分：白芍、秦艽、牡蠣、全蝎、蜈蚣、甘草。劑型：片劑；規(guī)格：0.35 g/片。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞造模方法：OA對(duì)照組和OA治療組采用改良Hulth造模法[10]，即將大鼠麻醉固定于手術(shù)臺(tái)上，無菌條件下去膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，切斷大鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶并縫合，保留關(guān)節(jié)軟骨面。假手術(shù)組暴露關(guān)節(jié)腔而不切斷前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶。三組均繼續(xù)飼養(yǎng)，任其自由活動(dòng)，可適當(dāng)給予抗生素預(yù)防感染。假手術(shù)組和OA對(duì)照組在建模2周后開始灌胃生理鹽水，OA治療組則灌胃等量芍藥舒筋片，1次/d，給藥持續(xù)4周。

2.2 觀察指標(biāo):培養(yǎng)4周后，連續(xù)8 d采用CCK-8溶液檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD)。軟骨組織學(xué)評(píng)分采用Mankin[11]評(píng)分。

培養(yǎng)4周后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qTR-PCR)檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)；采用qTR-PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達(dá)：參照文獻(xiàn)[12]，引物設(shè)計(jì)：Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’-ACCATTCGGCTAAACGGTC-3’，下游引物：5’-CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β上游引物：5’-GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，73 ℃延伸50 s，共循環(huán)32次，72 ℃、10 min。培養(yǎng)4周后，采用免疫印跡法(Western blot)[13]檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)。抽取細(xì)胞總蛋白，采用BCA方法鑒定蛋白濃度。

結(jié) 果

1 各組軟骨細(xì)胞增殖比較 OA對(duì)照組中軟骨細(xì)胞的增殖速率明顯低于假手術(shù)組，相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OA治療組中軟骨細(xì)胞的增值速率明顯高于OA對(duì)照組，相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨細(xì)胞增殖的OD值比較

2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分及miRNA-140的表達(dá)比較 OA對(duì)照組中Mankin評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，miRNA-140相對(duì)表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，且差異均具有意義(P<0.05)。OA治療組中Mankin評(píng)分明顯低于OA對(duì)照組，miRNA-140相對(duì)表達(dá)量明顯高于OA對(duì)照組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分及miRNA-140的表達(dá)比較

3 各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達(dá)比較 OA對(duì)照組和OA治療組中細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OA治療組中細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達(dá)水平明顯低于OA對(duì)照組，相比較差異均具有意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達(dá)比較

4 各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)比較 見表4(圖1)。OA對(duì)照組和OA治療組中細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OA治療組中細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)水平明顯低于OA對(duì)照組，相比較差異均具有意義(P<0.05)。

表4 各組軟骨細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達(dá)比較

注：GAPDH是蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)內(nèi)參

討 論

OA是一種退行性慢性關(guān)節(jié)疾病，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于“痹癥”“骨痹”范疇?！端貑枴庋ㄕ摗罚骸胺e寒留舍，榮衛(wèi)不居，卷肉縮筋，肋肘不得伸，內(nèi)為骨痹”指出骨痹與年老體衰、外感風(fēng)寒濕有關(guān)。年老肝腎虧損，經(jīng)骨失養(yǎng)，血瘀氣滯，風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)受阻[14]。因此，目前主要以補(bǔ)益肝腎、活血化瘀的藥物治療OA[15]。芍藥舒筋片主要由白芍、秦艽、牡蠣、全蝎、蜈蚣、甘草等構(gòu)成[16]。白芍養(yǎng)血柔肝，調(diào)經(jīng)止痛；秦艽祛濕止痹，清熱止痛；牡蠣滋陰壯陽；全蝎、蜈蚣通絡(luò)攻毒，鎮(zhèn)痙散結(jié)；甘草清熱解毒，諸藥合用，補(bǔ)益肝腎、散寒除濕、活血化瘀，對(duì)OA患者早中期肝腎虧損，血瘀經(jīng)阻等癥狀有較好的治療效果[17]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，OA對(duì)照組IL-1β誘導(dǎo)退化的軟骨細(xì)胞增值速率明顯降低，而OA治療組中軟骨細(xì)胞增值速率又明顯高于OA對(duì)照組。說明芍藥舒筋片治療能夠促進(jìn)退化軟骨細(xì)胞增殖。且研究結(jié)果顯示，OA對(duì)照組中Mankin評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，OA治療組中Mankin評(píng)分明顯低于OA對(duì)照組。說明芍藥舒筋片治療后能夠有效降低Mankin評(píng)分，延緩骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退變，對(duì)骨關(guān)節(jié)軟骨起到一定的保護(hù)作用。錢春美等[18]研究發(fā)現(xiàn)，芍藥舒筋片在高、中、低劑量下有較好的關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用，可降低Mankin評(píng)分，一定程度延緩機(jī)械失穩(wěn)造成的膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退變，這與本研究結(jié)果部分一致。OA對(duì)照組中miRNA-140相對(duì)表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，OA治療組中miRNA-140相對(duì)表達(dá)量明顯高于OA對(duì)照組。分析其中原因之一為IL-1β能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退化，且能夠抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miRNA-140的表達(dá)，而芍藥舒筋片能夠調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退化程度。所以在經(jīng)過IL-1β處理后的OA對(duì)照組中miRNA-140表達(dá)量明顯降低，服用芍藥舒筋片后的OA治療組miRNA-140表達(dá)量高于OA對(duì)照組[19-20]。

本研究結(jié)果顯示，OA對(duì)照組和OA治療組中細(xì)胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，OA治療組中的細(xì)胞Wnt-3a、

β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于OA對(duì)照組。說明芍藥舒筋片能夠降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，抑制其重要分子的miRNA和蛋白表達(dá)水平，從而延緩軟骨細(xì)胞的退變速率。分析其中原因之一為在軟骨細(xì)胞未分化時(shí)，Wnt-3a能夠明顯抑制miRNA-140的表達(dá)。因此，OA治療組中表達(dá)較高的miRNA-140能夠負(fù)調(diào)控Wnt-3a的表達(dá)水平，從而降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性[21-22]。

綜上，芍藥舒筋片能夠增加OA大鼠軟骨細(xì)胞中miRNA-140的相對(duì)表達(dá)量和軟骨細(xì)胞的增殖速率，降低Mankin評(píng)分，且能夠通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，延緩軟骨退變的作用機(jī)制，從而發(fā)揮其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。