新加歸腎丸通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖*

蔡 競，李 楠，朱虹麗△，張 輝，李海英

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712021)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

卵泡發(fā)育障礙是指卵泡發(fā)育、成熟或排出障礙，臨床上主要見于無排卵性不孕、黃體功能不足、閉經(jīng)、排卵障礙性異常子宮出血等疾病。無排卵性不孕占女方因素不孕的25%～30%[1]，嚴(yán)重影響了婦女的生殖健康。腎虛血瘀是此類疾病的主要病機(jī)，前期動物實驗研究表明：補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸通過調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路促進(jìn)雷公藤多苷致卵泡發(fā)育障礙大鼠模型卵巢顆粒增殖而促使卵泡發(fā)育[2-3]。顆粒細(xì)胞是卵巢中一類十分重要的細(xì)胞，被稱為卵巢中的“體細(xì)胞”，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生多種物質(zhì)可作為支持卵母細(xì)胞生長成熟的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。mTOR參與了體內(nèi)多條信號通路，其中PI3K/AKT信號通路是非常重要的一條，其促細(xì)胞增殖作用主要是通過mTOR實現(xiàn)的。鑒于顆粒細(xì)胞對于卵泡發(fā)育的重要性以及mTOR信號通路與細(xì)胞增殖的密切關(guān)系，在前期研究基礎(chǔ)之上，本研究以mTOR信號通路為切入點，觀察補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸對離體大鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響，通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究闡釋傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療疾病的靶點，為臨床治療用藥提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗藥物：新加歸腎丸的組成為菟絲子、淫羊藿、枸杞子、山茱萸、干地黃、當(dāng)歸、茺蔚子各10 g，肉蓯蓉20 g，生藥總劑量90 g(藥物購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中草藥房)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)制劑研究室制成中藥水提醇沉液。制備方法如下：上述藥物于去離子水浸泡15 min； 合并兩次煎煮液(每次煎煮15 min)； 冷卻、去沉淀；加入95%乙醇，配置成乙醇濃度為50%混合液；靜置過夜后離心、去沉淀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇；加去離子水溶至250 ml；離心后取上清；用0.1 mol/L，NaOH調(diào)10 ml水提純液pH值至6.8～7.4，過濾除菌，4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑和儀器：孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)(批號170823310)；胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)BS)(批號：SV30087.01)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(批號：C009)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(批號：KAG511)；雷帕霉素(批號：R8140)；兔抗磷酸化-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)多克隆抗體(批號：ab 63552)；兔抗細(xì)胞周期蛋白D2(Cyclin D2)多克隆抗體(批號：ab 7225)。超凈工作臺(型號：SW-CJ-2FD)；醫(yī)用離心機(jī)(型號：L530)；光學(xué)倒置顯微鏡(型號：XSZ-D2)；二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：FEARCELL 240i)。

1.3 實驗動物：23～25 日齡未成年SD雌性大鼠 10 只，體重(50±10)g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2009-0001。于室溫為22～25 ℃、濕度為45%～65%的條件下分籠喂養(yǎng)，晝夜交替光照，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

2 實驗方法

2.1 大鼠顆粒細(xì)胞的制備：參照文獻(xiàn)[5]方法制備并培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞：取23～25日齡SD雌性大鼠10只，每只頸部皮下注射PMSG 50 IU以促進(jìn)卵泡發(fā)育，用藥后48 h，以頸椎脫臼法處死大鼠，并將處死后大鼠迅速置入75%酒精中浸泡3 min。在無菌狀態(tài)下開腹，取出雙側(cè)卵巢、輸卵管及周圍脂肪組織，在超凈工作臺上用D-hank’s沖洗液反復(fù)沖洗組織，剪去輸卵管及多余脂肪。將卵巢放入無血清培養(yǎng)基中，注射器針頭刺破卵泡，輕輕擠壓出卵泡內(nèi)容物并收集，離心后加入培養(yǎng)液清洗2次，收集下沉之顆粒細(xì)胞，400目鋼篩過濾，離心，計數(shù)。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)藍(lán)染死亡細(xì)胞，并計算細(xì)胞活率，細(xì)胞存活率>90%。將顆粒細(xì)胞以1×106個/ml接種于培養(yǎng)板中，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后換液1次，去除未貼壁的細(xì)胞。

2.2 顆粒細(xì)胞分組及藥物處理：將細(xì)胞稀釋成1×106個/ml濃度，按1×105個/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后分為空白組，模型組，中藥低、中、高劑量組共五組，每組5個復(fù)孔。分別做以下處理：空白組加入含1%的FBS培養(yǎng)液；模型組加入含1%的FBS培養(yǎng)液及1.67 mg/ml的雷帕霉素；中藥低、中、高劑量組加入含1%的FBS培養(yǎng)液，加1.67 mg/ml的雷帕霉素處理20 min后，吸掉上清，并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗一遍，然后再分別加入MEM/F12培養(yǎng)基稀釋的不同濃度新加歸腎丸水提醇沉液(低劑量組：2×10-5g/L；中劑量組為2×10-4g/L；高劑量組為2×10-3g/L)。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后檢測。

2.3 觀察指標(biāo)及測定：流式細(xì)胞儀檢測顆粒細(xì)胞周期各時相的變化，并計算細(xì)胞增殖指數(shù)。分別在培養(yǎng)24、48、72 h后采用流式細(xì)胞儀檢測各組顆粒細(xì)胞周期各時相的變化。具體方法如下：①PBS清洗細(xì)胞2次，加入0.25 % 胰蛋白酶加0.02% 乙二胺四酸二鈉溶液消化細(xì)胞；②細(xì)胞之間的連接斷開、細(xì)胞變圓時立即加入10 %的DMEM/F12培養(yǎng)基，終止消化；③PBS 洗滌、離心、收集細(xì)胞沉淀、PBS洗滌、加入75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上；④離心、PBS、加入溴化乙錠復(fù)合染液，4 ℃避光孵育30 min；⑤上流式細(xì)胞儀檢測，讀取G0/G1期、S期、G2/M期的結(jié)果，并計算細(xì)胞增殖指數(shù)(Cell proliferation index，PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。免疫印跡法檢測顆粒細(xì)胞p-mTOR蛋白表達(dá)水平:提取細(xì)胞總蛋白；Bradford 法測定各組總蛋白濃度。 SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜；免疫雜交；化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶，凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行半定量分析，目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

結(jié) 果

1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞24、48、72 h細(xì)胞周期變化 用藥24、48、72 h這3個時段，模型組S期細(xì)胞比率、PI指數(shù)均低于空白組，相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥各個劑量組S期細(xì)胞比率、PI指數(shù)均高于模型組，相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥各個劑量組比較，除24 h時段S期細(xì)胞比率外，中藥中劑量組S期細(xì)胞比率、PI指數(shù)均高于其他兩組，相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在用藥48 h，中藥各組G1期向S期轉(zhuǎn)化均活躍，用藥72 h的G1期向S期轉(zhuǎn)化逐漸緩慢。見表1～3。

表1 各組顆粒細(xì)胞24 h細(xì)胞周期比率分布及PI指數(shù)

表2 各組顆粒細(xì)胞48 h細(xì)胞周期比率分布及PI指數(shù)

表3 各組顆粒細(xì)胞72 h細(xì)胞周期比率分布及PI指數(shù)

2 各組顆粒細(xì)胞24、48、72 h的Cyclin D2蛋白表達(dá) 用藥后24、48、72 h這3個時段，模型組Cyclin D2蛋白表達(dá)水平均低于空白組，相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥各個劑量組Cyclin D2蛋白表達(dá)水平均高于模型組，相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥各劑量組間比較，中藥中劑量組Cyclin D2蛋白表達(dá)水平均高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥高劑量組與低劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4(圖1～3)。

3 各組顆粒細(xì)胞24、48、72 h的p-mTOR蛋白表達(dá) 用藥后24、48、72 h這3個時段，模型組p-mTOR蛋白表達(dá)水平均低于空白組，相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥各個劑量組p-mTOR蛋白表達(dá)水平均高于模型組，相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥各個劑量組間比較，中藥中劑量組p-mTOR蛋白表達(dá)水平均高于其他兩組，相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中藥高劑量組與中藥低劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5(圖1～3)。

表4 各組顆粒細(xì)胞24、48、72 h的Cyclin D2蛋白相對表達(dá)量

表5 各組顆粒細(xì)胞24、48、72 h的p-mTOR蛋白相對表達(dá)量

圖1 各組顆粒細(xì)胞24 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表達(dá)

圖2 各組顆粒細(xì)胞48 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表達(dá)

圖3 各組顆粒細(xì)胞72 h的Cyclin D2、p-mTOR蛋白表達(dá)

討 論

顆粒細(xì)胞是卵泡最主要的功能單位，通過絲狀偽足和縫隙連接為卵母細(xì)胞提供了與外界交流的結(jié)構(gòu)通道，以利于卵泡的生長發(fā)育[6]。有報道指出，與同顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)的未成熟卵母細(xì)胞(由給幼年雌性大鼠注射孕馬血清促性腺素促排卵后獲得)比較，單獨培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟率明顯降低；且前者IVF成功率和活胎出生率接近于IUI[7]。說明顆粒細(xì)胞對于促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟是必需的。細(xì)胞周期可劃分為G0/G1期、S期、G2期和M期4個連續(xù)時期，在S期DNA開始合成，而細(xì)胞DNA水平可反映細(xì)胞增殖力[8]。細(xì)胞周期的順利進(jìn)行是細(xì)胞增殖的重要條件[9]。如果能夠促進(jìn)細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變，就能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之則會導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1期，進(jìn)而發(fā)生凋亡。Cyclin D2是細(xì)胞周期G1/S的正性調(diào)節(jié)因子[10]。在卵巢組織中，Cyclin D2主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞上，垂體切除的雌性小鼠卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)Cyclin D2表達(dá)水平非常低，從而抑制顆粒細(xì)胞增殖及卵泡生長[11]。FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖實驗表明：磷酸化P70S6K水平和Cyclin D2mRNA水平均明顯升高，而在應(yīng)用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素處理后，兩者水平均明顯降低[12]，說明Cyclin D2作為mTOR信號通路的下游分子在卵巢顆粒細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要的作用。

腎為先天之本、元氣之根，主生殖，腎藏精，精化氣，精生血，血養(yǎng)精，卵子又屬腎中生殖之精，卵泡的正常發(fā)育有賴于腎精的充盛，卵子的順利排出有賴于腎氣的鼓動，補(bǔ)腎填精是治療卵泡發(fā)育障礙性疾病的基本方法。腎精虧損可通過多個環(huán)節(jié)導(dǎo)致瘀血形成[13]。反過來，瘀血又會影響腎的生理功能，造成虛實夾雜的病理機(jī)制。因此在治療此類疾病時，常在補(bǔ)腎填精的基礎(chǔ)之上添加養(yǎng)血活血之品，使得精血源足，血脈流暢，卵子得以正常發(fā)育排出而受孕。林湫瑩[14]通過研究46篇有關(guān)中藥治療卵巢儲備功能下降相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該病中醫(yī)證型分布以腎精虧虛證最為常見，腎虛血瘀證位居第二，印證了此類疾病本虛標(biāo)實的病機(jī)根本。新加歸腎丸基于“腎藏精，主生殖”“精血足則卵泡長而有源，氣血暢則卵泡動而有力”中醫(yī)生殖理論，以“補(bǔ)腎活血”為法，由景岳名方歸腎丸加減化裁而成，具體方藥如下，肉蓯蓉、菟絲子、淫羊藿、枸杞子、山茱萸、干地黃、當(dāng)歸、茺蔚子。方中肉蓯蓉甘溫專補(bǔ)腎中水火，菟絲子平潤補(bǔ)陽益陰，填髓充精，共奏補(bǔ)腎陽，益精血之功，共為主藥。淫羊藿助肉蓯蓉補(bǔ)腎壯陽；干地黃養(yǎng)陰血，填骨髓，性甘寒，又制淫羊藿之溫燥；山萸肉酸澀，平補(bǔ)肝腎，助陽益精，補(bǔ)中寓澀，共為輔藥。枸杞子滋陰補(bǔ)血益精，與菟絲子皆為種仁；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，補(bǔ)而不滯；茺蔚子活血通經(jīng)，理氣開郁，瀉而通之，瀉有形之瘀，共為佐使藥。全方陰陽并舉，通補(bǔ)兼施，共助補(bǔ)腎活血。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在小鼠初級卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加mTOR抑制劑雷帕霉素后，停滯在有絲分裂G1期的顆粒細(xì)胞比例也呈劑量依賴性增加，可見雷帕霉素可通過抑制mTOR信號通路阻滯卵巢顆粒細(xì)胞增殖[15-16]。因此本實驗選擇雷帕霉素預(yù)處理的顆粒細(xì)胞為實驗對象。本實驗研究結(jié)果表明：在各個時間段，模型組p-mTOR、Cyclin D2表達(dá)均低于空白組，S期細(xì)胞比率和PI指數(shù)均低于空白組，說明雷帕霉素可抑制離體大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖；應(yīng)用新加歸腎丸水提醇沉液后各個濃度組p-mTOR、Cyclin D2表達(dá)、S期細(xì)胞比率、PI指數(shù)均高于模型組，說明補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸可促進(jìn)被雷帕霉素抑制的顆粒細(xì)胞的增殖，這種促進(jìn)作用可能是通過激活mTOR信號通路，上調(diào)Cyclin D2蛋白表達(dá)，促使顆粒細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，推動細(xì)胞周期進(jìn)程實現(xiàn)。這與前期實驗研究結(jié)果[2]相吻合。因此我們推測：補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸可能通過激活mTOR信號通路活性，加速卵巢顆粒細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖來實現(xiàn)改善卵泡發(fā)育，為臨床治療卵泡發(fā)育障礙性疾病提供診療思路。